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Rapport De Stage Hplc

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Catégorie: Divers

Soumis par: Mirielle 18 aoút 2011

Mots: 9193 | Pages: 37

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......................................................................................................12 3.5 La colonne...........................................................................................................................12 3.6 Le détecteur.........................................................................................................................13 3.7 Le logiciel............................................................................................................................13 4 Domaine d’application de l’HPLC .............................................................................................13 II Les hydrocarbures aromatiques polycycliques .........................................................................14 III Méthodologie...............................................................................................................................14 1. Préparation des solutions mères des différents HAPs ...............................................................14 2. Protocole de la méthode mise en place......................................................................................15 IV Résultats et Discussion................................................................................................................17 1. Identification de quelques hydrocarbures aromatiques polycycliques ......................................17 2. Etalonnage et validation de la méthode .....................................................................................21 2.1 La répétabilité de l’anthracène...........................................................................................21 2.2 La répétabilité du pyrène ....................................................................................................25 2.3 La reproductibilité de l’anthracène ....................................................................................26 2.4 La reproductibilité du pyrène .............................................................................................28 V Conclusion.....................................................................................................................................31 Références bibliographiques ...........................................................................................................32 Annexes .............................................................................................................................................33

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Liste des tableaux Tableau I : Gradient d’élution. Tableau II : Réalisation de la gamme d’étalonnage Tableau III : Comparaison de paramètres physico-chimiques entre deux solvants : l’acétonitrile et le méthanol Tableau IV : Données statistiques calculées sur la gamme de répétabilité Tableau V : Données statistiques calculées sur la gamme de reproductibilité

Liste des figures Figure 1: Schéma explicatif de l’appareillage de l’HPLC. Figure 2 : Fonctionnement de l’HPLC Figure 3: Les deux phases de l’injection avec une vanne. Figure 4 : Chromatogramme illustrant un gradient d’élution appliqué sur 9 hydrocarbures aromatiques polycycliques. Figure 5 : Chromatogramme de séparation de cinq hydrocarbures aromatiques polycycliques avec une proportion de 70 % de méthanol. Figure 6 : Chromatogramme de séparation de cinq hydrocarbures aromatiques polycycliques avec 65 % de méthanol dans la phase mobile Figure 7 : Séparation de trois HAPs moyennement lourds. Listes des graphiques Graphique 1 : Droite d’étalonnage de l’anthracène de la répétabilité Graphique 2 : Graphe des résidus de l’anthracène en répétabilité. Graphique 3 : Courbe d’étalonnage en modèle quadratique Graphique 4 : Graphe des résidus de l’anthracène en modèle quadratique Graphique 5 : Droite de validation indirecte de l’anthracène du modèle quadratique Graphique 6 : Courbe d’étalonnage du pyrène en répétabilité. Graphique 7 : Graphe des résidus du pyrène en répétabilité.

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Graphique 8 : Droite d’étalonnage de l’anthracène en reproductibilité. Graphique 9 : Graphe des résidus de l’anthracène en reproductibilité. Graphique 10 : Courbe d’étalonnage de l’anthracène en modèle quadratique. Graphique 11 : Graphe des résidus de l’anthracène en modèle quadratique. Graphique 12 : Courbe d’étalonnage en modèle quadratique. Graphique 13 : Droite d’étalonnage du pyrène lors de la réproductibilité. Graphique 14 : Graphe des résidus du pyrène en reproductibilité.

Liste des annexes

Annexe A : Données statistiques de validation du dosage de l’anthracène dans les conditions de répétabilité Annexe B : Données statistiques de validation du dosage du pyrène dans les conditions de répétabilité Annexe C : Données statistiques de validation du dosage de l’anthracène dans les conditions de reproductibilité Annexe D : Données statistiques de validation du dosage de l’anthracène dans les conditions de reproductibilité Annexe E : Acquisitions des données de l’anthracène et du pyrène

Liste des abréviations HPLC : High Performance Liquid Chromatography CPL : Chromatographie en phase liquide CPG : Chromatographie en phase gazeuse SAA : Spectrométrie d’Absorption Atomique HAP : Hydrocarbures Aromatiques Polycycliques

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Glossaire

Elution : durée du processus d’analyse entre l’injection et la sortie du produit de la colonne Eluant : composition de la phase mobile utilisée pour faire migrer les produits sur une colonne Phase mobile : un fluide qui traverse la colonne Phase stationnaire : Adsorbant contenu dans la colonne avec lequel les solutés entrent en interaction. Temps de rétention : Temps mesuré entre l’injection et le maximum du pic chromatographique Temps mort : temps mis par la phase mobile pour traverser la colonne (également temps mis par les solutés n’ayant aucune affinité pour la phase stationnaire pour traverser la colonne).

DESCRIPTION DE LA STRUCTURE D’ACCUEIL

L'UFR SciFA (Unité de Formation et de Recherche Sciences Fondamentales et Appliquées) est l’unité qui regroupe les domaines de la chimie, de la biologie, de la physique, de l’électronique ainsi que les filières STAPS (Sciences et Techniques des Activités Physiques et Sportives) de l’Université Paul Verlaine. Elle est administrée par un Conseil d'UFR et dirigée par un Directeur élu par le Conseil. Actuellement, il s’agit de Mr. XXX, élu jusqu’en 2014. Les formations disponibles à l’UFR SciFA appartiennent au domaine « Sciences et Technologies » de l’université Paul VerlaineMetz. Parmi les nombreuses disciplines enseignées, on distingue la chimie et la biologie qui, au cours de leur formation, utilisent des techniques analytiques s’effectuant dans la salle

« appareillage » à l’Institut de Chimie, Physique et des Matériaux. Cette salle est équipée de nombreux appareils tels que l’HPLC, la CPG, la SAA, le fluorimètre et un spectromètre à cuve, l’électrophorèse capillaire. Elle est occupée une centaine d’heures dans l’année par 75 à 100 étudiants provenant de filières différentes (licence physique-chimie, licence chimie bioorganique, master environnement et aménagement, master chimie…).

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INTRODUCTION

Depuis de nombreuses années, le développement des activités polluantes anthropiques affecte l’environnement. C’est pourquoi, au XXIe siècle, la protection de l’environnement est devenue un enjeu majeur. En effet, l’accumulation de polluants divers dans l’environnement n’est plus acceptable. Ainsi la préservation de l’environnement constitue un des trois piliers du développement durable.

L’étude de la qualité des composantes de l’environnement (eau, air, sol) est réalisée par des laboratoires d’analyses. Ceux-ci font appel au domaine de la chimie analytique, plus précisément de la chromatographie. Cette technique consiste à séparer les constituants d’un mélange pollué et à les quantifier, via l’utilisation de méthodes spécifiques. Afin d’assurer la fiabilité de ces méthodes d’analyses et donc leur validation, des systèmes d’assurance qualité dans les laboratoires ont été mis en place. La validation de méthode est souvent perçue comme une contrainte car elle fait appel à des démarches statistiques parfois mal maitrisées par les analystes. Cependant, le laboratoire a tout à gagner en utilisant des méthodes qui fournissent des résultats exacts pour les clients.

Dans cette étude, il s’agira, tout d’abord, de prendre en main la chromatographie en phase liquide de l’Institut de Chimie, Physique et Matériaux en réalisant une série de tests qui permettra de contrôler régulièrement les appareillages d’analyse utilisés en travaux pratiques. Dans un deuxième temps, nous évaluerons la fiabilité de dosage (validation de méthode) de deux HAPs avec étalonnage interne par un troisième.

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I) SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE

1. Historique de la chromatographie en phase liquide

Bien que certains historiens fassent remonter l’origine de la chromatographie à l’Antiquité, on retient généralement comme point de départ dans ce domaine, les travaux, en 1906, du chimiste-botaniste russe, Mikhail Semonovich TSWEET, qui a réussi à séparer des pigments végétaux colorés sur une colonne remplie de carbonate de calcium pulvérulent, entrainés avec de l’éther de pétrole (mélange pentanes et d’hexanes). Il a observé sur la colonne la formation de bandes de couleurs différentes (vertes, orange, jaunes) donnant ainsi le nom de chromatographie à cette technique. Cette technique fut pratiquement abandonnée jusqu’en 1930 où Lederer et Khun séparent à une échelle préparative les carotènes et les xanthophylles. Reichstein, en 1938, introduit le « chromatogramme liquide » en séparant des substances incolores et montre ainsi le principe de l’élution. Vers 1940, Martin et Synge développent la pratique et la théorie de la chromatographie de partage sur gel de silice et obtiennent le prix Nobel en 1952. C’est cette même année que la chromatographie en phase gazeuse sur colonne remplies est apparue (James et Martin). A partir de 1969 la chromatographie en phase liquide à haute performance commence réellement à se répandre grâce à l’amélioration de ces performances analytiques et du matériel.

Hormis la spectrométrie de masse (qui peut également servir de détection chromatographie), peu de techniques analytiques ont connu un tel essor au cours des cinq dernières décennies. Cet engouement peut s’expliquer par la richesse des systèmes séparatifs et des détecteurs à disposition pour réaliser des analyses. Son succès est également dû au fait que cette technique permet aussi bien des analyses qualitative que quantitative avec une grande sensibilité. De ce fait, la chromatographie est bien adaptée à l’analyse de mélanges complexes tels que l’on peut rencontrer dans les domaines de la biologie, de l’environnement, de l’industrie, des matériaux etc.

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2. Principe de la chromatographie La littérature et la documentation concernant la chromatographie est très abondante [13]. La chromatographie est une technique analytique qui permet la séparation des constituants d'un mélange en phase homogène liquide ou gazeuse. Le principe repose sur l’entrainement d’un échantillon dissous dans la phase mobile à travers la phase stationnaire de fine granulométrie. Celle-ci retient plus ou moins fortement les substances contenues dans l’échantillon dilué selon l’intensité des forces d’interaction de faibles énergies entre les différentes espèces moléculaires et la phase stationnaire. Les composés présents dans l’échantillon à analyser parcourent la colonne plus ou moins rapidement selon leurs propriétés intrinsèques (taille, structure…) et/ou à leur affinité avec la phase stationnaire (polarité, état de charge électrique…). En sortie de colonne, un détecteur mesure en continu la quantité de chacun des constituants du mélange. Les différents composants de l’échantillon ont généralement un temps de rétention spécifiques qui permet de les séparer, voire de les identifier. La qualité de la séparation dépend de la composition de la phase mobile et stationnaire. Pour être identifiés, les composés sont souvent comparés avec des substances souvent connues (substance étalon). Les substances étalons servent de références pour établir des étalonnages quantitatifs. En absence d’étalon, certains détecteurs structuraux comme le spectromètre de masse permettent l’identification de composés inconnus.

Figure 1 : Schéma explicatif de l’appareillage de l’HPLC.

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3. Instrumentation

3.1 Fonctionnement

Un appareil de chromatographie en phase liquide (figure 2) comporte quatre parties : un système de pompes permettant de délivrer la phase mobile (éluant), une vanne d’injection munie d’une boucle permettant à introduire l’échantillon dans le système chromatographie, une colonne et un détecteur.

Figure 2 : Fonctionnement de l’HPLC

3.3 La pompe

La pompe est l’appareil qui permet de forcer la phase mobile à traverser la colonne. Elle est munie de dispositifs en particulier dont un vise (vanne ou chambre de mélange) à constituer la composition de la phase mobile à partir de réservoirs de solvants indépendants. Si la composition de la phase mobile est fixe, l’élution est dite en mode isocratique si la vanne de mélange permet une évolution ou une programmation de la composition de la phase mobile au cours du temps, l’élution est dite en mode gradient. Cette pompe doit délivrer la phase mobile à un débit stable et non pulsé. La qualité de la pompe est très importante car elle permet d’avoir une ligne de base parfaitement stable et de fournir du solvant sans rupture dans le temps. La pompe avec laquelle j’ai travaillé permet de combiner jusqu’à 4 solvants : c’est donc une pompe quaternaire.

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3.4 L’injecteur ou vanne d’injection

Ce dispositif (figure 3) permet d’introduire un échantillon à pression atmosphérique dans le système chromatographique à haute pression via une boucle de volume calibré. L’élément le plus important de la vanne est le rotor qui étant percé de trous et de sillons permet de mettre en communication six différentes voies selon sa position. L’injection se déroule en deux temps. En position chargement (figure 3a), la boucle est à pression atmosphérique. L’échantillon est introduit à l’aide d’une seringue en position 4 du rotor, l’excédent d’échantillon ressort en position 1 en communication par un sillon avec la sortie. La pompe (entrée 2) est directement liée à la colonne (sortie 3) par un sillon du rotor. La position injection (figure 3b) et obtenue par une rotation du rotor d’un sixième de tour. La pompe est reliée à la boucle par un sillon. Le contenue de la boucle est rincé à contre courant et l’échantillon est transféré à la colonne. Ce dispositif calibré permet d'avoir un volume injecté constant, ce qui est important pour l'analyse quantitative.

Figure 3 : Les deux phases de l’injection avec une vanne

3.5 La colonne

La colonne est un tube en inox plus ou moins long de section constante (diamètre interne 1 mm à 30 mm pour des longueurs généralement de 5 à 25 cm. Ce long tube contient la phase stationnaire dont les propriétés chimiques dépendent de la nature des composés à analyser.

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Les principales phases stationnaires les plus couramment utilisées sont :

La phase normale : elle est constituée de gel de silice. Ce matériau est très polaire, il faut donc utiliser un éluant peu polaire (apolaire). Ainsi lors de l’injection d’une solution, les produits polaires sont retenus dans la colonne, contrairement aux produits apolaires qui sortent plus rapidement. La phase inverse : elle est constituée majoritairement de silice greffée par des chaines linéaires de n-alcanes, souvent à 8 ou 18 atomes de carbones. Ce matériau est très peu polaire et nécessite donc un éluant polaire. Dans ce cas, ce sont les composés polaires qui seront élués en premier. Ces phases comptent parmi les supports les plus stables chimiquement et donc forts appréciés des chromatographistes dans l’industrie. 3.6 Le détecteur

Les détecteurs les plus souvent utilisées sont les détecteurs UV (classique ou à barrette de diode). C’est d’ailleurs un détecteur UV classique qui est disponible sur la chaine utilisé.

- Le Détecteur UV-visible mesure l'absorption de la lumière par le produit à la sortie de la colonne. On opère à longueur d'onde constante, celle-ci ayant été fixée par l'opérateur. La lampe Deutérium est utilisée pour des longueurs d'ondes variant de 190-350 nm. Pour que ce type de détecteur soit utilisable, il faut que le produit à détecter absorbe la lumière à une longueur d'onde accessible à l'appareil, et que son coefficient d'absorption λ soit suffisamment grand la phase mobile n'absorbe pas la lumière à la longueur d'onde choisie par l'opérateur.

3.7 Le logiciel

Il y a une dizaines d’année, les données chromatographiques étaient relativement lourd à traiter. Aujourd’hui, grâce aux progrès informatiques, l’utilisation de la chromatographie est devenue plus facile et permet d’acquérir des données en peu de temps.

4. Domaine d’application de l’HPLC Dès lors qu’un soluté présente une volatilité faible, l’utilisation de la chromatographie en phase liquide à haute pression est préférable. En effet, elle présente un champ d’application

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très vaste, elle est particulièrement employée en cosmétologie ou en biochimie mais également dans l’analyse environnementale de l’eau, du sol, la recherche de polluants etc. Elle est aussi utilisée dans les laboratoires d’analyses médicales pour évaluer la quantité de vitamines, en toxicologie pour la détection de drogues, la quantification et l’identification de métabolites…

III) LES HYDROCARBURES POLYCYCLIQUES AROMATIQUES

Les hydrocarbures aromatiques peuvent être d’origine naturelle [4-5] mais ils proviennent principalement des processus de pyrolyse ou la combustion incomplète de matières organiques (incinération des déchets agricoles, la combustion du bois, du charbon ou des ordures ménagères mais également le fonctionnement des moteurs à essence ou des moteurs diesels). Les HAPs sont rarement présents à très fortes concentrations dans l’environnement, ils ont la particularité de se trouver sous forme de mélanges plus ou moins complexes. En effet, compte tenu de la diversité des sources de production des HAPs, un mélange complexe de centaines de composés chimiques incluant les HAPs et les dérivés de HAPs, est retrouvé dans l’environnement. Ils sont biodégradés dans les couches superficielles du sol et la majorité des HAPs présents dans les eaux de surface sont issus des dépôts atmosphériques. De plus, les périodes de pollution atmosphériques, la combustion de la cigarette ainsi que l’alimentation favorisent l’exposition de la population à des teneurs en HAPs plus ou moins fortes.

IV METHODOLOGIE

1. Préparation des solutions mères d’hydrocarbures aromatiques

polycycliques : Chacune des solutions mères sera préparée à une concentration de 100mg/l. Pour cela, on prélève 0.01 g du composé concerné que l’on transvase dans une fiole jaugée de 100 ml, complétée avec le solvant utilisé lors de l’analyse. Celle-ci est diluée par 10 et 80 µl sont injectés à l’aide de la seringue.

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2. Séparation par chromatographie en phase liquide Pendant la période de prise en main de la chromatographie en phase liquide, deux HAPs, le biphényle et le fluorène ont été séparés avec succès en mode isocratique. Le solvant utilisé pour effectuer cette analyse était le méthanol. La colonne utilisée contient une phase stationnaire greffée (chaine alkyle linéaire à 18 atomes de carbone) apolaire. La granulométrie de la phase stationnaire est de l’ordre de 5 µm. Sur C18, la rétention des composés est assurée par des solvants polaires (solvant faible). Cette rétention peut être modulée par l’ajout d’un solvant plus apolaire (solvant fort) que le premier. Si un composé est trop retenue, on ajoute plus de solvant fort et inversement. Dans nos analyses, le solvant faible est l’eau et les solvants forts sont l’acétonitrile ou le méthanol. Par la suite, d’autres composés plus polaires que les premiers tels que le benzhydrol et la benzophénone ont été ajoutés au mélange, en plus du naphtalène. Ainsi, une solution de benzhydrol, de benzophénone, de naphtalène, de fluorène et de biphényle préparée à une concentration de 10 mg/l a été analysée en modifiant la composition de la phase mobile pour permettre une bonne séparation des composés. Un mode gradient a été programmé sur le logiciel EzChrom Elite, en augmentant progressivement la quantité de méthanol introduite. La composition de ce gradient est indiquée dans le tableau I :

Temps (min) 0 1 10

Eau (%) 35 35 5 Tableau I : Gradient d’élution.

Méthanol (%) 65 65 95

Le mode gradient est appliqué sur neuf hydrocarbures aromatiques polycycliques différents: le benzhydrol, la benzophénone, le naphtol, le naphtalène, le biphényle, le fluorène, l’anthracène, le fluoranthène et le pyrène.

Après avoir obtenu la séparation de ces neuf hydrocarbures aromatiques polycycliques, trois hydrocarbures moyennement lourds ont été sélectionnés pour réaliser une

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étude permettant de valider une méthode de dosage en mode isocratique. Il s’agit de l’anthracène, le fluoranthène (qui servira d’étalon interne) et le pyrène.

Pour réaliser la répétabilité du système, trois gammes d’étalonnage de ces composés sont préparées à partir des solutions mères de 100 mg/l. Pour cela, le fluoranthène, l’étalon interne, est introduit à une concentration égale. Les détails volumétriques des solutions sont indiqués dans le tableau II.

Concentration

2.5 5 10 15 20

Volume de Volume de Volume Volume fluoranthène pyrène d’anthracène d’acétonitrile (ml) introduit (ml) introduit (ml) (ml) 1 0.25 0.25 8.5 1 0.5 0.5 8 1 1 1 7 1 1.5 1.5 6 1 2 2 5 Tableau II : Réalisation de la gamme d’étalonnage

Volume final (ml) 10 10 10 10 10

Pour évaluer la reproductibilité, trois gammes d’étalonnage indépendantes sont préparées à partir de solutions mères différentes.

Lors de ces séquences d’analyses, on injectera des échantillons contrôles (QC, pour quality control en anglais) qui servent à valider la justesse et la précision de cette méthode (exactitude). Pour la répétabilité, on injecte six fois le même échantillon de concentration 2.5 mg/l (QC bas), six fois le même échantillon de 10 mg/l (QC Médian) et six fois le même échantillon de 20 mg/l (QC haut). Pour la reproductibilité, nous aurons également six QC à chaque niveau (bas, médian, haut). Nous prendrons les deux valeurs de chaque niveau de QC de la première gamme de répétabilité, puis nous effectuerons deux injections de QC de chaque niveau avec les deux autres gammes de reproductibilité. La colonne analytique utilisée a pour longueur 10 cm et la phase mobile utilisée est un mélange d’eau et d’acétonitrile (15/85 ; v/v) à un débit de 1 ml/min. Les droites d’étalonnage de l’anthracène et du pyrène seront tracées à partir des aires relatives à l’étalon interne comme suit :

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Les données sont collectées et traitées par Excel (Microsoft) après avoir programmé les calculs adéquats. Les différents paramètres seront l’homogéinité des variances par le test de Cochran, l’existence d’une pente significative par le test de Fischer 1, l’adéquation du modèle par le test de Fischer 2 et la compatibilité de l’ordonnée à l’origine à 0 (comme le prévois la loi de Beer-Lambert) par un test de Student. A partir de ces données, il est possible de valider un modèle linéaire ou par la suite un modèle quadratique.

IV RESULTATS ET DISCUSSIONS

1. Identification de quelques hydrocarbures aromatiques polycycliques

Comme

nous

l’avons

mentionné

précédemment,

neuf

HAPs

(benzhydrol,

benzophénone, naphtol, naphtalène, biphényle, fluorène, anthracène, fluoranthène et le pyrène) ont été analysé par HPLC. Rappelons que la détection se fait en UV et la matérialisation du temps mort se fait par une perturbation du signal UV à 30 secondes. Ceci est d’ailleurs compatible avec les dimensions de la colonne pour le débit utilisé. Pour une colonne de 4,6 de diamètre, on compte une minutre pour dix cm, les 30 secondes sont compatibles avec les 5 cm de longueur de la colonne utilisée.

Avant de passer au mélange des neuf HAPs, la séparation d’un mélange plus simple composé de cinq hydrocarbures aromatiques a été étudiée sur la colonne de 5 cm en condition isocratique en faisant varier la composition de la phase mobile, constituée de méthanol et d’eau. On constate ainsi que sur les figures 4 et 5 illustrant les chromatogrammes, il apparait que les composés sont d’autant plus retenus qu’ils possèdent un nombre de carbones croissant, donc une hydrophobie croissante [2]. En ce qui concerne le benzhydrol et la benzophénone, possédant un nombre de carbone identique, l’ordre d’élution s’explique par la nature de la fonction –OH qui est plus polaire que la fonction cétone. Dans le mélange eau/méthanol, le méthanol est le solvant le moins polaire et donc représente le solvant « fort » (qui permet une élution plus rapide en augmentant l’affinité du soluté pour la phase mobile). On remarque que la rétention est plus lente lorsque la proportion de méthanol est

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fixée à 65 %. Ainsi, en augmentant sa proportion par exemple à 70%, la rétention des solutés est diminuée. Ceci peut s’expliquer en calculant le facteur de rétention de chacun de ces composés qui représente une des grandeurs fondamentales qui caractérise la séparation.

(min) (min) Voici, le tableau illustrant les facteurs de rétention calculés pour des compositions de la phase mobile différentes :

Composés 70 % de méthanol 65 % de méthanol

Benzhydrol 1,76 2,24

Benzophénone 2,7 3,57

Naphtalène 4,65 6,45

Biphényle 7,19 10,9

Fluorène 10,18 15,87

D’après la littérature, la séparation est optimale pour 2 < k < 10 afin que le temps de passage des constituants ne soit pas trop long. On constate que le facteur de rétention, pour le composé le plus polaire (benzhydrol) est meilleur lorsque la phase mobile est constitué de 65 % de méthanol. C’est pourquoi, la séparation des composés les plus polaires, en mode gradient, se feront en utilisant la composition de cette phase mobile (65% de méthanol).

Figure 4 : Chromatogramme de séparation de cinq hydrocarbures aromatiques polycycliques avec 65 % de méthanol dans la phase mobile (RP18 50 x 4,6 mm ID, 3,5 µm)

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Figure 5 : Chromatogramme de séparation de cinq hydrocarbures aromatiques polycycliques avec une proportion de 70 % de méthanol (RP18 50 x 4,6 mm ID, 3,5 µm)

Le gradient d’élution présenté dans la figure 6, est réalisé à partir d’un mélange composé de 9 hydrocarbures aromatiques plus ou moins lourds et polaires. On utilise de l’eau et du méthanol comme solvants. Pour que les composés polaires tels que la benzophénone, le naphtol et le benzhydrol soient élués, il est indispensable d’apporter une proportion d’eau (polaire) suffisante (65% dans ce gradient) pour éviter que ces derniers sortent en volume mort. En ce qui concerne les hydrocarbures suivants (naphtalène, biphényle, fluorène, anthracène, fluoranthène et le pyrène), l’élution de ces derniers est fonction de leur nombre de carbone et de la proportion de méthanol (qui s’accroit au cours de l’analyse). En effet, plus le nombre de carbone est grand, et plus la rétention des composés sera grande mais plus la proportion en méthanol augmente et moins les solutés sont retenus.

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Figure 6 : Chromatogramme illustrant le gradient d’élution décrit dans le tableau I (p16) appliqué sur 9 hydrocarbures aromatiques polycycliques (RP18 50 x 4,6 mm ID, 3,5 µm).

Le chromatogramme de la figure 7 représente la séparation des trois hydrocarbures les plus lourds de cette étude et dont l’élution est tardive en utilisant de l’acétonitrile comme éluant. L’acétonitrile remplace le méthanol utilisé précédemment car il permet l’élution des composés beaucoup plus hydrophobes.

Paramètre de Miscibilité à l’eau polarité 81°C 0,52 Oui acétonitrile 64,5°C 0,7 Oui méthanol Tableau II : Comparaison de paramètres physico-chimiques entre de deux solvants : l’acétonitrile et le méthanol

Solvant

T° ébullition

On constate qu’en utilisant de l’acétonitrile, la rétention des composés est moins importante, on obtient une séparation en moins de 5 minutes contrairement au méthanol. Ceci s’explique par le fait que l’acétonitrile est plus apolaire que le méthanol, de plus ils n’appartiennent pas aux mêmes groupes de sélectivité selon la théorie de Snyder [3] même si dans notre cas ce n’est pas obligatoirement un problème puisque les trois HAPs sélectionnés ne sont ni accepteur, ni donneur de protons.

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Figure 7 : Séparation de trois HAPs moyennement lourds (C18 150x 3,9 mm ID, 5 µ).

2. Etalonnage et validation de la méthode La demande en analyse est de plus en plus importantes notamment dans le domaine environnemental. La plupart du temps, il s’agit de quantifier les polluants dans les matrices telles que les eaux, les sols, les aliments (ex : pesticides et leurs résidus), les fluides des tissus biologiques (empoisonement). Pour étudier la qualité des analyses et en garantir les résultats, les industries sont soumises à des exigences réglementaires qui visent à s’assurer de leur fiabilité. Cette étape de validation des méthodes analytiques est indispensable pour instaurer une véritable confiance dans les résultats obtenus. L’étape de validation met en œuvre des études statistiques décrites dans la littérature [6-9] dont il peut également ressortir des indices sur les modifications à entreprendre pour améliorer la fiabilité des résultats.

2.1 La répétabilité de l’anthracène

Afin de caractériser les performances des méthodes d’analyses, des caractéristiques telles que la spécificité (aptitude à ne détecter que la molécule souhaitée), sélectivité (aptitude à distinguer spécifiquement chaque molécule détectée), la linéarité (réponse du détecteur en fonction de la concentration), l’exactitude (justesse et précision) sont souvent étudiées à partir d’expériences. Dans l’exactitude, on retrouvera les notions de répétabilité (variabilité de la réponse sans changement des conditions opératoires et la reproductibilité (variabilité de la réponse avec changements infimes des conditions opératoires).

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Dans le cadre de l’analyse des trois HAPs, la méthode de détection n’est pas spécifique mais la colonne permet d’assurer une sélectivité de détection ainsi l’anthracène est détecté à 3 minutes, le fluoranthène à 3,4 minutes et le pyrène à 3,9 minutes avec un bon retour à la ligne de base du chromatogramme. Nous pouvons alors étudier l’évolution de la réponse du détecteur en fonction de la concentration de l’échantillon. Les résultats d’étalonnage ont été exploités par un modèle linéaire comme le suggère la loi de Beer-Lambert. Valider un modèle de réponse nécéssite la réalisation d’au moins trois gammes d’étalonnage desquelles seront tirées les satistiques nécéssaires. La première étape consiste à vérifier par un test de Cochran que les variances des réponses du détecteur UV restent homogènes en fonction de la quantité injectée (ce qui a toujours été le cas au cours de nos manipulations). Le deuxième test consiste à s’assurer qu’il existe une pente significative, c’est-à-dire à s’assurer que la variation de la réponse n’est pas aléatoire mais bien fonction de la concentration en analyte. Ceci est réalisé grâce à un test de Fisher (F1) qui vise à s’assurer que la variance expliquée par la régression est significative devant la variance non expliquée (résiduelle). L’adéquation du modèle linéaire est assurée par une nouvelle analyse de variance (F2) qui vise à s’assurer que le défaut de modèle est significativement inférieur à l’erreur expérimentale. Ces deux tests sont bien entendu donné pour une certaine prise de risque α=0,05. Si le modèle linéaire est validé dans le cadre de la loi de Beer-Lambert il a également vérifier que la valeur de l’ordonnée à l’origine était compatible avec 0 par un test de student approprié. Après validation de la loi de réponse, l’exactitude de la méthode a été vérifier grace à l’injection d’échantillon contrôle en étudiant la justesse (aptitude à donner un résultat le plus proche de la réalité) et la précision (étude de la dispersion des résulats). La méthode est validée si elle est exacte c’est-à-dire à la fois juste et précise. Ces tests ont été effectué pour ces deux composés, anthracène et pyrène, sur une série de 3 gammes provenant de la meme préparation (répétabilité) et sur trois gamme de préparation indépendendante (reproductibilité). Pour l’anthracène, le graphique 1 montre une linéarité médiocre comme en peut en témoigner le coefficient de détermination (R²= 0,969).

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Graphique 1 : Droite d’étalonnage de l’anthracène en répétabilité

L’étude du graphe de résidus (écart entre les points observés et le modèle) montre que les résidus suivent une courbe parabolique (graphique 2). Cette forme particulière trahit plutôt un modèle quadratique comme le suggère le graphique 3 et le coefficient de détermination de ce modèle de régression (R²=0,998).

Graphique 2 : Graphe des résidus de l’anthracène en répétabilité.

Une telle dérive par rapport à la loi de Beer-Lambert peut s’expliquer par un phénomène de saturation du détecteur pour lequel, la concentration en analyte étant trop importante, la linéarité est perdue.

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Le modèle quadratique a été validé. En validant que les concentrations calculées à partir du modèle quadratique sont corrélées aux concentrations injectées. Les concentrations recalculées par le modèles s’obtiennent en résolvant la droite d’équation dans laquelle y représente la réponse du détecteur et x la concentration en analyte. Il faut donc résoudre l’équation en calculant le discriminant

pour chacune des concentrations et trouver les solutions à partir de la formule . En portant , on doit obtenir une

droite de pente unitaire et d’ordonnée à l’origine nulle. Le graphique 4 confirme le modèle quadratique. En effet, les résidus calculées se répartissent de façon homogènes autour de la droite résidus=0.

Graphique 3 : Courbe d’étalonnage en modèle quadratique

Graphique 4 : Graphe des résidus de l’anthracène en modèle quadratique

24

Graphique 5 : Droite de validation indirecte du modèle quadratique pour l’anthracène.

Le graphique 5 représente la droite de validation indirecte du modèle quadratique pour l’anthracène. Grâce aux études statistiques décrites précédemment, nous avons pu démontré que la relation était bien linéaire (test F1 et F2) et que l’ordonnée à

l’origine et la pente valaient bien respectivement 0 et 1. Ceci valide le modèle quadratique. Le modèle linéaire est rejeté ici car la concentration en anthracène est trop élévée. ceci est confirmé visuellement par son pic de chromatographique qui est très intense par rapport au pic du pyrène. Une dilution de ce composé serait donc nécéssaire pour recouvrer un modèle linéaire.

2.2 La répétabilité du pyrène

Pour le pyrène, le graphique 6 montre une bonne linéarité de réponse comme peut en témoigner le coefficient de détermination de la droite de régression (R²=0,998). Cependant, le test de Fisher 2 a rejeté le modèle linéaire. Le coefficient de détermination ne suffit donc pas à démontrer l’exactitude du modèle meme si il traduit une bonne tendance correcte à l’alignement des points de gamme.

25

Graphique 6 : Courbe d’étalonnage du pyrène en répétabilité

L’examen du graphe du résidu pour cet étalonnage est très informatif. Ce graphe montre une alternance positive et de négative des résidus (graphique 7). Ceci traduit ici la présence d’erreurs systématiques liées à la préparation d’échantillons supérieures aux erreurs de mesures de l’appareillage.

Graphique 7 : Graphe des résidus du pyrène en répétabilité.

2.3 La reproductibilité de l’anthracène

Le graphique 8 montre que la linéarité est toujours aussi médiocre comme peut en témoigner le coefficient de détermination (R²=0,9026). Comme dans le cadre de la répétabilité, il est possible d’invoquer la non linéarité du modèle. Cependant, on constate également l’existence d’une valeur éloignée de la droite pour une injection à la concentration

26

de 20 mg/l. Afin de juger d’un aberrances éventuelle de cette valeur, un test de Grubbs a été réalisé sur les résidus de cette série de valeurs. Ainsi, la valeur du résidus de 1,9894 observée dans le 5ème niveaux de concentration 20 mg/l est utilisée dans la formule du test de Grubbs suivante :

Avec :

= la moyenne s= l’écart-type

Les calculs ont montré que cette valeur était aberrante. Néanmoins, le modèle reste quadratique à cette concentration d’anthracène.

Graphique 8 : Droite d’étalonnage de l’anthracène lors de la reproductibilité.

En effet, l’étude du graphe de résidus (graphique 9) montre à nouveau une tendance de répartition parabolique conforme au modèle quadratique.

27

Graphique 9 : Graphe des résidus de l’anthracène en reproductibilité.

2.4 La reproductibilité du pyrène

La régression linéaire appliquée au pyrène (graphique 13) en reproductibilité permet l’obtention d’un coefficient de détermination acceptable (R²=0,9826).

Graphique 13 : Droite d’étalonnage du pyrène en reproductibilité.

Bien que certaines valeurs de résidus soient dispersées, le test de Cochran n’a montré pas de variance significativement plus élévé pour un risque de 5 %. L’étude du graphe des résidus montre qu’ils se répartissent de façon homogène de part et d’autre de l’axe des résidus nuls (grapique 14). Ce genre de répartition est favorable à une validation du modèle ce qui a été démontrer par la suite des test F1 et F2. Le modèle linéaire est ainsi validé pour le pyrène.

28

Graphique 14 : Graphe des résidus du pyrène en reproductibilité.

Le modèle linéaire étant validé pour le pyrène, il reste à validé l’exactitude de la méthode (la justesse et la précision) qui sera étudiée à partir des concentrations calculées des échantillons controles (valeurs des QCs données en annexes E). Le plan expérimental classique pour une mesure de répétabilité et de reproductibilité fait appel à la mesure de trois niveaux de concentrations (bas, moyen, haut) et pour 3 jours différents ou 3 séquences d’injections indépendantes. Pour se faire, les paramètres tels que la moyenne des concentrations et leur écart type seront calculés afin de déterminer le coefficient de variation. La justesse sera estimée par l’écart entre la moyenne des mesures et la concentration théoriques des échantillons de contrôle. La précision sera estimée à partir de l’écart type relative ou coefficient de variation qui permet d’exprimer la variabilité des résultats par rapport à la moyenne. Le coefficient de variation se calcule ainsi :

CV % = =la moyenne s= l’écart-type CV=Coefficient de variation

s × 100 x

29

Les tableaux IV et V résument les résultats obtenus en matière de reproductibilité et de répétabilité pour cette étude. L’intervalle de confiance des concentrations calculées est donné à 95 %.

Gamme de répétabilité Bas Médian Haut

Nombre d’injections 6 6 6

Concentration calculée (mg/l) 2,46 ± 0,01 9,91 ± 0,03 19,69 ± 0,05

Justesse %

98,4 99,1 98,4

CV %

0,26 0,28 0,22

Tableau IV : Données statistiques calculées sur la gamme de répétabilité

Les résultats obtenus (tableau IV) montrent que la justesse relative est très proche de 100 % avec un coefficient de variation très faible ce qui est tout à fait acceptable pour valider l’exactitude de la méthode car moins de 2 % d’erreur sont commis sur la détermination de ce composé.

Gamme de Nombre Concentration Exact % CV % reproductibilité d’injections calculée (mg/l) 6 102 5,3 Bas 2,55 ± 0,14 6 99,8 1,1 Médian 9,91 ± 0,11 6 97,5 1,2 19,5 0,23 Haut Tableau V : Données statistiques calculées sur la gamme de reproductibilité

Il est habituellement admis qu’un coefficient de variation de 3 à 4 % est tolérable dans les conditions de reproductibilité. Or, on constate que les échantillons bas de gamme présentent un coefficient de variation atteignant 5,3 %. Il est possible d’expliquer un tel coefficient de variation par des valeurs particulièrement hautes (2,716 et 2,727 mg/l) pour les QC de la deuxième gamme par rapport à la valeur théorique attendue (2,5 mg/l). Ceci mériterait d’être vérifier par la suite. Néanmoins, l’ensemble des résultats pour le pyrène sont encourageants car seules ces deux déterminations sont à tester à nouveau sur les 60 mesures que comporte une validation totale de la méthode d’analyse (environ 3 % des données à vérifier).

30

G/ CONCLUSION

La pollution chimique de l’environnement n’a cessé d’augmenter avec l’industrialisation et l’urbanisation croissante. Parmi les polluants organiques majeurs de notre environnement, les hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAPs) font l’objet d’une attention particulière dans les différents domaines d’activités de l’environnement nécessitant, ainsi, la réalisation d’analyses. C’est pourquoi, dans cette étude, les hydrocarbures aromatiques polycycliques ont été choisis pour la séparation par chromatographie en phase liquide. Ainsi, différents tests ont été réalisés, en mode isocratique ou en mode gradient pour observer la rétention de chacun des HAPs qui est fonction de leur polarité. Nous avons donc mis en place une méthode permettant la quantification de trois HAPs, l’anthracène, le fluoranthène et le pyrène considérés comme lourds du fait de leur élution tardive. La validation de cette méthode a fait appel à des statistiques démontrant que chacune des droites d’étalonnage suivait soit un modèle linéaire, soit un modèle quadratique. Cette validation a été réalisée au travers de tests d’homogénéité des variances, de validité de droite etc. Les résultats obtenus ont démontré que la droite d’étalonnage du pyrène suit un modèle linéaire contrairement à l’anthracène dont le modèle linéaire n’est pas validé. Un tel phénomène permet à l’analyste de détecter d’éventuels problèmes liés soit à la manipulation ou à l’appareillage. En chromatographie en phase liquide, le détecteur UV ne présente en principe aucune variation même en utilisant une lampe ancienne, celle-ci n’influe pas sur la séparation et la quantification des HAPs. Etant donné la linéarité prouvée sur le pyrène, le modèle quadratique de l’anthracène peut s’expliquer par son pic sur le chromatogramme qui est largement plus grand que le pic du pyrène et donc une dilution de ce composé aurait été nécessaire. Néanmoins, la reproductibilité présente de meilleurs résultats et minimise l’erreur de manipulation effectuée lors de la réalisation de la gamme de répétabilité. Malgré la non validité du modèle linéaire de l’anthracène, les résultats sont très encourageants et doivent pouvoir être améliorés

31

Références bibliographiques : [1] F. ROUESSAC, A. ROUESSAC, Analyse chimique-Méthodes et techniques instrumentales modernes. 5e Ed, Dunot, Paris.

[2] XXX, Cours de Master 1 Génie de l’environnement, Université de Metz.

[3] R. ROSSET, M. CAUDE, A. JARDY, 1991. Chromatographies en phases liquides et supercritiques. 3e Ed, Masson

[4] J.-M COSTES, V.DRUELLE, 1997. Les hydrocarbures aromatiques polycycliques dans l’environnement : la réhabilitation des anciens sites industriels, revue de l’institut français du pétrole, VOL. 54 N° 4, Paris.

[5] Institut nationale de l’environnement industriel et des risques (http://rsde.ineris.fr/fiches/fiche_hydrocarbures_aromatiques_polycycliques_hap_2005_VF.p df ) consulté en mai 2010.

[6] J. CAPORAL-GAUTIER, JM. NIVET, ALGRANDI P., GUILLOTEAU M., HISTE M., LALLIER M., GUYEN-HUU J.J., RUSSOTTO R ., 1992. STP Pharma Pratique, 2(4) : 205239

[7] M. FEINBERG, 1996. La validation des méthodes d’analyse-Une approche chimiométrique de l’assurance qualité. Masson, Paris.

[8] XXX, Cours de Licence Professionnelle « Analyse-Contrôle », IUT d’Orléans..

[9] « Guidance for Industry, Bioanalytical Method Validation », U.S department of Health and Human services, Food and Drug Administration (FDA), Center for Drug Evaluation and research (CDER), Center for Veterinary Medecine (CVM), May 2001.

32

Annexe A : Données statistiques de validation du dosage de l’anthracène dans les conditions de répétabilité

33

y = bx+a

Classe (k) 25 xi 2,50 2,50 2,50 5,00 5,00 5,00 10,00 10,00 10,00 15,00 15,00 15,00 20,00 20,00 20,00 157,5 10,50 yi 2,5230 2,4930 2,4780 4,1640 4,1690 4,1450 6,4050 6,3790 6,2060 8,1360 7,8550 8,0630 9,1560 8,9400 9,2340 90,346 6,02 yc 3,0338 3,0338 3,0338 3,9679 3,9679 3,9679 5,8362 5,8362 5,8362 7,7045 7,7045 7,7045 9,5729 9,5729 9,5729 90,346 ykm 2,4980 (yi-yc)² 0,260888 0,292435 0,308883 0,038445 0,040430 0,031355 0,323493 0,294593 0,136726 0,186154 0,022637 0,128490 0,173767 0,400504 0,114822 2,75362 xi² 6 6 6 25 25 25 100 100 100 225 225 225 400 400 400 2269 (x i-xm)² 64,0000 64,0000 64,0000 30,2500 30,2500 30,2500 0,2500 0,2500 0,2500 20,2500 20,2500 20,2500 90,2500 90,2500 90,2500 615 (yi-ym)² 12,2504667 12,4613707 12,5674977 3,4561289 3,4375632 3,5271344 0,1458731 0,1266885 0,0334646 4,4644873 3,3559797 4,1613280 9,8152713 8,5085001 10,3100929 88,6218 (yik-ykm)² 0,00063 0,00002 0,00040 0,00002 0,00009 0,00021 0,00563 0,00240 0,01538 0,01392 0,02657 0,00202 0,00212 0,02890 0,01538 0,11368 S²y 0,000525 [a(xi-ykm)+b]² 2,87E-01 2,87E-01 2,87E-01 3,66E-02 3,66E-02 3,66E-02 2,44E-01 2,44E-01 2,44E-01 9,83E-02 9,83E-02 9,83E-02 2,14E-01 2,14E-01 2,14E-01 2,64E+00 residus Delta Graphe des résidus en modèle 0,5108 0,37 2,391684858 0,5408 0,37 2,342269617 0,8000 0,5558 0,37 2,317601961 0,6000 -0,1961 0,28 5,280290469 -0,2011 0,28 5,28973122 0,4000 -0,1771 0,28 5,244456286 0,2000 -0,5688 0,16 10,0905183 -0,5428 0,16 10,0259825 0,0000 -0,3698 0,17 9,60335597 0,00 -0,4315 5,00 10,00 15,28856621 15,00 -0,2000 0,07 -0,1505 0,08 14,27575384 -0,4000 -0,3585 0,07 15,0157917 0,4169 0,02 20,53803094 -0,6000 0,6329 0,03 19,04283618 -0,8000 0,3389 0,01 21,2124292 Concentration (mg/l)

linéaire -0,11

-0,16 -0,18 0,28 0,29 0,24 0,09 0,03 -0,40 20,000,29 -0,72 0,02 0,54 -0,96 1,21

50

4,1593

0,000160

100

6,3300

0,011701

Résidus

25,00

150

8,0180

0,021259

200 Sommes Moy.

9,1100

0,023196 0,056841333

N k pente origine r²

15 5 0,37366 2,09962 0,96893

Sy/x = Sr Sa ΣT ΣR Σr ΣE ΣL

15,320133 0,46024 0,22824 88,62185 85,86823 2,75362 0,1136827 2,63994

Ecart type / ordonnée à l'origine Variation totale (à N-1 DDL) Variation Regression (à 1 DDL) Variation résiduelle (à N-2 DDL) Erreur experimentale (N-k DDL) Erreur de linéarité (à k-2 DDL)

pente (a) Sa r² F1 S²R

DROITEREG 0,373661789 2,099617886 Ord. Orig. (b) 0,018558498 0,228239342 Sb 0,968928422 0,460235774 Sr 405,3887992 13 ddl 85,86822635 2,753620585 Σrésidus²

a b c

-0,01327628 0,66994946 0,99663442

Homogénéité des variances (Cochran) Sy²max = Cc(0,05,5,2) = 0,02320 ΣSy² = C = Sy²max/ΣSy² = 0,05684

0,6838 0,40808 10,0000 9,0000 8,0000 7,0000 6,0000 5,0000 4,0000 3,0000 2,0000 1,0000 0,0000 0,00

Graphe des résidus modèle quadratique

y = 0,374x + 2,100 2 R = 0,969 1,50 1,00 0,50

Validité de la droite SE² = 0,01137 SL ² = 0,87998

Area Ratio

Existance d'une pente significative SR² = Fc(0,01,1,13) = 85,8682 Sr² = F1 = SR²/Sr² = 0,21182

17,81542 405,38880

Fc(0,05,3,10) = F2 = SL²/SE² =

3,708265 77,40664

y = -0,013x + 0,670x + 0,997 R2 = 0,998

5,00 10,00 15,00 20,00

2

0,00 0,00 -0,50 -1,00 -1,50 5,00 10,00 15,00 20,00 25,00

Test ordonné origine// 0 Sb = 0,22824

C (mg/l)

t(0,05,13) = b/Sb 2,160369 9,1991935

b

2,09962

Annexe B : Données statistiques de validation du dosage du l’anthracène dans les conditions de reproductibilité

y = bx+a

Classe (k) 25 xi 2,50 2,50 2,50 5,00 5,00 5,00 10,00 10,00 10,00 15,00 15,00 15,00 20,00 20,00 20,00 157,5 10,50 yi 2,522626 2,055599 2,081398 4,164013 3,584929 3,476066 6,405058 5,673944 5,246148 8,136265 7,580998 6,824163 9,156049 8,886948 6,824163 82,618 5,51 yc 2,7242 2,7242 2,7242 3,5941 3,5941 3,5941 5,3339 5,3339 5,3339 7,0737 7,0737 7,0737 8,8135 8,8135 8,8135 82,618 ykm 2,2199 (yi-yc)² 0,040626 0,447009 0,413176 0,324807 0,000084 0,013931 1,147359 0,115624 0,007702 1,128991 0,257326 0,062281 0,117311 0,005389 3,957624 8,03924 xi² 6 6 6 25 25 25 100 100 100 225 225 225 400 400 400 2269 (xi-xm)² 64,0000 64,0000 64,0000 30,2500 30,2500 30,2500 0,2500 0,2500 0,2500 20,2500 20,2500 20,2500 90,2500 90,2500 90,2500 615 (yi-ym)² 8,9118078 11,9183217 11,7408552 1,8060092 3,6977826 4,1283128 0,8049083 0,0275736 0,0685093 6,9083489 4,2977726 1,7325721 13,3090508 11,4180244 1,7325721 82,5024 (yik-ykm)² 0,09166 0,02699 0,01918 0,17837 0,02457 0,07055 0,39691 0,01022 0,27974 0,38745 0,00451 0,47561 0,75168 0,35748 2,14590 5,22082 S²y 0,068910 [a(xi-ykm)+b]² 2,54E-01 2,54E-01 2,54E-01 2,18E-02 2,18E-02 2,18E-02 1,95E-01 1,95E-01 1,95E-01 1,94E-01 1,94E-01 1,94E-01 2,75E-01 2,75E-01 2,75E-01 2,82E+00 S²y 3,104245 residus Delta 0,2016 0,27 0,6686 0,88 0,6428 0,85 -0,5699 -0,75 0,0092 0,01 0,1180 0,16 -1,0711 -1,41 -0,3400 -0,45 0,0878 0,12 -1,0625 -1,40 -0,5073 -0,67 0,2496 0,33 -0,3425 -0,45 -0,0734 -0,10 1,9894 2,63 -4,44E-16 0,757780569

50

3,7417

0,136743

3,654605

100

5,7751

0,343435

5,946870

150

7,5138

0,433789

5,773218

200 Sommes Moy.

8,2891

1,627531 2,610407535

19,634699

N k pente origine r²

15 5 0,34796 1,85428 0,90256

Sy/x = Sr Sa ΣT ΣR Σr ΣE ΣL

14,266489 0,78639 0,38998 82,50242 74,46318 8,03924 5,2208151 2,81842

Ecart type / ordonnée à l'origine Variation totale (à N-1 DDL) Variation Regression (à 1 DDL) Variation résiduelle (à N-2 DDL) Erreur experimentale (N-k DDL) Erreur de linéarité (à k-2 DDL)

pente (a) Sa r² F1 S²R

DROITEREG 0,347963138 1,854278432 Ord. Orig. (b) 0,031710147 0,389983238 Sb 0,902557533 0,786386061 Sr 120,4120579 13 ddl 74,4631823 8,039239478 Σrésidus²

a b c

-0,01375984 0,6550425 0,71112097

Homogénéité des variances (Cochran) Sy²max = Cc(0,05,5,2) = 1,62753 ΣSy² = C = Sy²max/ΣSy² = 2,61041

0,6838 0,62348

Titre du graphique

Existance d'une pente significative SR² = Fc(0,01,1,13) = 74,4632 Sr² = F1 = SR²/Sr² = 0,6184 17,81542 120,41206

Graphe des résidus en modèle linéaire

2,5000 2,0000 1,5000 Résidus 1,0000 0,5000 0,0000 -0,50000,00 5,00 10,00 15,00 20,00 25,00

Validité de la droite SE² = 0,52208 SL² = 0,93947

Fc(0,05,3,10) = F2 = SL²/SE² =

3,708265 1,79948

10 8 6 4 2 0 0,00

y = 0,348x + 1,8543 2 R = 0,9026

Area Ratio

5,00

10,00

Concentration (mg/l)

15,00

20,00

-1,0000 -1,5000 Concentration (mg/l)

Test ordonné origine// 0 Sb = 0,38998

t(0,05,13) = b/Sb

2,160369 4,7547644

b

1,85428

Annexe C : Données statistiques de validation du dosage du pyrène dans les conditions de reproductibilité

y = bx+a

Classe (k) 25 xi 2,50 2,50 2,50 5,00 5,00 5,00 10,00 10,00 10,00 15,00 15,00 15,00 20,00 20,00 20,00 157,5 10,50 yi 0,227281 0,228 0,251373 0,437352 0,429 0,424145 0,746914 0,827 0,766703 1,117047 1,282 1,101975 1,392904 1,632 1,457037 12,320 0,82 yc 0,2436 0,2436 0,2436 0,4242 0,4242 0,4242 0,7852 0,7852 0,7852 1,1463 1,1463 1,1463 1,5074 1,5074 1,5074 12,320 ykm 0,2356 (yi-yc)² 0,000266 0,000243 0,000060 0,000174 0,000019 0,000000 0,001470 0,001751 0,000344 0,000858 0,018353 0,001969 0,013120 0,015559 0,002541 0,05673 xi² 6 6 6 25 25 25 100 100 100 225 225 225 400 400 400 2269 (x i-xm)² 64,0000 64,0000 64,0000 30,2500 30,2500 30,2500 0,2500 0,2500 0,2500 20,2500 20,2500 20,2500 90,2500 90,2500 90,2500 615 (yi-ym)² 0,3529291 0,3520754 0,3248842 0,1474616 0,1542907 0,1577795 0,0055421 0,0000329 0,0029874 0,0874314 0,2120238 0,0787451 0,3266634 0,6574321 0,4040863 3,2644 (yik-ykm)² 0,00007 0,00006 0,00025 0,00005 0,00000 0,00003 0,00111 0,00220 0,00018 0,00249 0,01320 0,00422 0,01023 0,01908 0,00137 0,05454 S²y 0,000188 [a(xi-ykm)+b]² 6,48E-05 6,48E-05 6,48E-05 3,44E-05 3,44E-05 3,44E-05 2,51E-05 2,51E-05 2,51E-05 4,24E-04 4,24E-04 4,24E-04 1,80E-04 1,80E-04 1,80E-04 2,19E-03 residus 0,0163 0,0156 -0,0078 -0,0132 -0,0044 0,0000 0,0383 -0,0418 0,0185 0,0293 -0,1355 0,0444 0,1145 -0,1247 0,0504

50

0,4300

0,000045

100

0,7802

0,001745

150

1,1669

0,009954

200 Sommes Moy.

1,4940

0,015340 0,027271694

N k pente origine r²

15 5 0,07222 0,06305 0,98262

Sy/x = Sr Sa ΣT ΣR Σr ΣE ΣL

2,961003 0,06606 0,03276 3,26436 3,20764 0,05673 0,0545434 0,00219

Ecart type / ordonnée à l'origine Variation totale (à N-1 DDL) Variation Regression (à 1 DDL) Variation résiduelle (à N-2 DDL) Erreur experimentale (N-k DDL) Erreur de linéarité (à k-2 DDL)

pente (a) Sa r² F1 S²R

DROITEREG 0,072219586 0,063053749 Ord. Orig. (b) 0,00266374 0,032759667 Sb 0,982621857 0,066058597 Sr 735,066132 13 ddl 3,207636218 0,056728598 Σrésidus²

Homogénéité des variances (Cochran) Sy²max = Cc(0,05,5,2) = 0,01534 ΣSy² = C = Sy²max/ΣSy² = 0,02727

0,6838 0,56250

Abs.

Existance d'une pente significative SR² = Fc(0,01,1,13) = 3,20764 Sr² = F1 = SR²/Sr² = 0,00436

1,5

17,81542 735,06613

y = 0,0722x + 0,0631 R2 = 0,9826

Résidus

Graphe des residus en modèle linéaire

0,1500 0,1000

1 0,5

0,0500 0,0000 0,00 -0,0500 -0,1000 5,00 10,00 15,00 20,00 25,00

Validité de la droite SE² = 0,00545 SL² = 0,00073

Fc(0,05,3,10) = F2 = SL²/SE² =

3,708265 0,13355

0 0,00

5,00

10,00

C (mg/l)

15,00

20,00

Test ordonné origine// 0 Sb = 0,03276

-0,1500 Concentration (mg/l)

t(0,05,13) = b/Sb

2,160369 1,9247372

b

0,06305

Annexe D : Données statistiques de validation du dosage du pyrène dans les conditions de répétabilité

y = bx+a

Classe (k) 25 xi 2,50 2,50 2,50 5,00 5,00 5,00 10,00 10,00 10,00 15,00 15,00 15,00 20,00 20,00 20,00 157,5 10,50 yi 0,2273 0,2463 0,2482 0,4374 0,4396 0,4415 0,7469 0,7484 0,7541 1,1170 1,1150 1,1275 1,3929 1,4006 1,4200 11,863 0,79 yc 0,2576 0,2576 0,2576 0,4242 0,4242 0,4242 0,7575 0,7575 0,7575 1,0908 1,0908 1,0908 1,4241 1,4241 1,4241 11,863 ykm 0,2406 (yi-yc)² 0,000918 0,000126 0,000088 0,000172 0,000236 0,000299 0,000112 0,000083 0,000012 0,000688 0,000584 0,001348 0,000973 0,000555 0,000017 0,00621 xi² 6 6 6 25 25 25 100 100 100 225 225 225 400 400 400 2269 (x i-xm)² 64,0000 64,0000 64,0000 30,2500 30,2500 30,2500 0,2500 0,2500 0,2500 20,2500 20,2500 20,2500 90,2500 90,2500 90,2500 615 (yi-ym)² 0,3176063 0,2964888 0,2944637 0,1249585 0,1233839 0,1220407 0,0019300 0,0018020 0,0013489 0,1064069 0,1050590 0,1133567 0,3624731 0,3717434 0,3958264 2,7389 (yik-ykm)² 0,00018 0,00003 0,00006 0,00000 0,00000 0,00000 0,00001 0,00000 0,00002 0,00001 0,00002 0,00006 0,00013 0,00002 0,00024 0,00079 S²y 0,000134 [a(xi-ykm)+b]² 2,88E-04 2,88E-04 2,88E-04 2,33E-04 2,33E-04 2,33E-04 5,94E-05 5,94E-05 5,94E-05 8,43E-04 8,43E-04 8,43E-04 3,85E-04 3,85E-04 3,85E-04 5,43E-03 residus 0,0303 0,0112 0,0094 -0,0131 -0,0154 -0,0173 0,0106 0,0091 0,0034 -0,0262 -0,0242 -0,0367 0,0312 0,0235 0,0041 Delta 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00

50

0,4395

0,000004

100

0,7498

0,000014

150

1,1199

0,000045

200 Sommes Moy.

1,4045

0,000195 0,000393216

N k pente origine r²

15 5 0,06666 0,09093 0,99773

Sy/x = Sr Sa ΣT ΣR Σr ΣE ΣL

2,7330049 0,02186 0,01084 2,73889 2,73268 0,00621 0,0007864 0,00543

Ecart type / ordonnée à l'origine Variation totale (à N-1 DDL) Variation Regression (à 1 DDL) Variation résiduelle (à N-2 DDL) Erreur experimentale (N-k DDL) Erreur de linéarité (à k-2 DDL)

pente (a) Sa r² F1 S²R

DROITEREG 0,066658656 0,090930842 Ord. Orig. (b) 0,00088145 0,0108404 Sb 0,997732019 0,021859245 Sr 5718,971111 13 ddl 2,732676512 0,006211746 Σrésidus²

Homogénéité des variances (Cochran) Sy²max = Cc(0,05,5,2) = 0,00020 ΣSy² = C = Sy²max/ΣSy² = 0,00039

0,6838 0,49604

1,5000 1,0000

Area Ratio

Existance d'une pente significative SR² = Fc(0,01,1,13) = 2,73268 Sr² = F1 = SR²/Sr² = 0,00048

y = 0,067x + 0,091 R2 = 0,998

residus

0,0400 0,0300 0,0200 0,0100 0,0000 -0,01000,00 5,00 10,00 15,00 20,00 25,00 -0,0200 -0,0300

17,81542 5718,97111

0,5000 0,0000 0,00

Validité de la droite SE² = 7,9E-05 SL² = 0,00181

Fc(0,05,3,10) = F2 = SL²/SE² =

3,708265 22,99545

5,00

10,00

C (mg/l)

15,00

20,00

-0,0400 -0,0500

Test ordonné origine// 0 Sb = 0,01084

t(0,05,13) = b/Sb

2,160369 8,3881448

b

0,09093

Annexe E : Acquisitions des données de l’anthracène et du pyrène

Gamme 1 Temps de rétention Concentration 2,5 5 10 15 20 QC bas QC bas QC bas QC bas QC bas QC bas Anthracène 3,297 3,227 3,217 3,22 3,217 3,217 3,213 3,22 3,217 3,217 3,217 Fluoranthène Pyrène Anthracène 3,743 3,66 3,647 3,647 3,643 3,65 3,647 3,65 3,65 3,65 3,65 4,24 4,15 4,133 4,137 4,133 4,137 4,133 4,137 4,137 4,137 4,137 7356238 13078386 20073145 26088975 30789191 9928993 7361716 7301349 7289701 7677463 7287730 Aire Fluoranthène 2916103 3140813 3133952 3206505 3362716 3153584 2945899 2925773 2920932 3100085 2921883 Pyrène 662775 1373641 2340794 3581818 4683941 1006072 727460 720701 720317 762185 719068 Area Ratio 2,523 4,164 6,405 8,136 9,156 3,148 2,499 2,496 2,496 2,477 2,494 0,227 0,437 0,747 1,117 1,393 0,319 0,247 0,246 0,247 0,246 0,246 Back calculated 1,076 5,430 11,374 15,966 18,671 2,736 1,013 1,004 1,004 0,954 1,001 2,171 5,354 10,044 15,652 19,832 3,561 2,469 2,460 2,464 2,452 2,456 Anthracène Pyrène Anthracène Pyrène

Droite d'étalonnage de la répétabilité du Pyrène de la gamme 1 1,600

1,400 1,200 Area Ratio 1,000 0,800 0,600 0,400 0,200 0,000 0 5 10 15 Concentration (mg/l) 20 25 Pyrène y = 0,0666x + 0,0845 R2 = 0,9971

Gamme 2 Répétabilité Temps de rétention Anthracène 2,5 5 10 15 20 QC Median QC Median QC Median QC Madian QC Median QC Madian 3,217 3,217 3,22 3,22 3,22 3,22 3,22 3,22 3,22 3,22 3,22 Fluoranthène Pyrène Anthracène 3,65 3,647 3,65 3,65 3,65 3,65 3,65 3,65 3,65 3,65 3,65 4,137 4,137 4,137 4,14 4,137 4,137 4,14 4,137 4,137 4,137 4,137 7280091 12310402 19975299 26928331 31461513 20020695 19847814 19993040 19909046 19673802 19946018 Aire Fluoranthène 2919811 2952820 3131646 3428136 3519200 3162444 3118116 3143306 3124490 3094606 3141017 Pyrène 719263 1298019 2343714 3822285 4928831 2362929 2332734 2353216 2346819 2313812 2360850 Area Ratio 2,493 4,169 6,379 7,855 8,940 6,331 6,365 6,361 6,372 6,357 6,350 0,246 0,440 0,748 1,115 1,401 0,747 0,748 0,749 0,751 0,748 0,752 Back calculated 0,904 5,533 11,637 15,716 18,713 11,505 11,600 11,587 11,619 11,579 11,559 2,293 5,221 9,900 15,454 19,781 9,882 9,896 9,904 9,941 9,889 9,949 Anthracène Pyrène Anthracène Pyrène

Droite d'étalonnage de la répétabilité du Pyrène de la gamme 1

1,600 1,400 1,200 1,000 0,800 0,600 0,400 0,200 0,000 0 5 10 Titre de l'axe y = 0,0661x + 0,0954 R2 = 0,9983

Pyrène

15

20

25

Titre de l'axe Gamme 3 Répétabilité Temps de rétention Anthracène 2,5 5 10 15 20 QC Haut QC Haut QC Haut QC Haut QC Haut QC Haut 3,213 3,217 3,22 3,217 3,22 3,217 3,217 3,22 3,217 3,217 3,217 Fluoranthène Pyrène Anthracène 3,643 3,647 3,647 3,643 3,647 3,647 3,643 3,647 3,643 3,647 3,643 4,133 4,133 4,133 4,133 4,133 4,133 4,13 4,137 4,13 4,133 4,13 7243530 12133666 20526296 25543650 30006939 29811712 30192242 30258415 30239248 30439992 30125601 Aire Fluoranthène 2922588 2927315 3307316 3168035 3249717 3230571 3300222 3312246 3310554 3357581 3300385 Pyrène 725391 1292420 2494113 3572055 4614579 4572038 4649964 4677797 4671694 4722825 4659694 Area Ratio 2,478 4,145 6,206 8,063 9,234 9,228 9,149 9,135 9,134 9,066 9,128 0,248 0,442 0,754 1,128 1,420 1,415 1,409 1,412 1,411 1,407 1,412 Back calculated 1,214 5,588 10,998 15,871 18,944 18,929 18,721 18,686 18,683 18,504 18,666 2,331 5,216 9,882 15,456 19,821 19,750 19,656 19,706 19,689 19,621 19,699 Anthracène Pyrène Anthracène Pyrène

Droite d'étalonnage de la répétabilité du Pyrène de la gamme 1

2,000 Area Ratio 1,500 1,000 0,500 0,000 0 5 10 15 20 25 Concentration (mg/l) Pyrène y = 0,0672x + 0,0928 R2 = 0,9985

Gamme 4 Reproductibilité Temps de rétention Anthracène 2,5 5 10 15 20 QC bas QC bas QC Median QC Median QC Haut QC Haut 3,26 3,207 3,177 3,167 3,17 3,17 3,18 3,183 3,183 3,18 3,187 Fluoranthène Pyrène Anthracène 3,7 3,637 3,597 3,583 3,587 3,593 3,603 3,603 3,607 3,6 3,607 4,193 4,123 4,077 4,063 4,067 4,07 4,083 4,083 4,087 4,083 4,09 7025489 11478392 18581595 23780523 27501914 6467027 6465893 18521470 18701085 29440540 28330918 Aire Fluoranthène 3417733 3201846 3274899 3136859 3094641 3163753 3171460 3277073 3314890 3506710 3331694 Pyrène 779606 1372186 2708660 4020888 5051015 775068 779749 2712411 2753551 5563947 5254851 Area Ratio 2,056 3,585 5,674 7,581 8,887 2,044 2,039 5,652 5,642 8,395 8,503 0,228 0,429 0,827 1,282 1,632 0,245 0,246 0,828 0,831 1,587 1,577 Back calculated 1,478 5,420 10,804 15,719 19,085 1,449 1,435 10,747 10,720 17,818 18,097 2,507 4,982 9,902 15,516 19,842 2,716 2,727 9,910 9,946 19,280 19,163 25,000 20,000 Area Ratio 15,000 10,000 Anthracène Pyrène Anthracène Pyrène

Droite d'étalonnage de la reproductibilité du pyrène de la gamme 2

y = 1,0044x + 0,0036 R2 = 0,9986

Pyrène 5,000 0,000 0 5 10 15 20 25 Concentration (mg/l)

Gamme 5 Reproductibilité Temps de rétention Anthracène 2,5 5 10 15 20 QC bas QC bas QC Median QC Median QC Haut QC Haut 3,183 3,183 3,187 3,187 3,19 3,187 3,187 3,19 3,19 3,187 3,193 Fluoranthène Pyrène Anthracène 3,61 3,607 3,61 3,607 3,613 3,61 3,61 3,61 3,61 3,61 3,617 4,093 4,09 4,09 4,09 4,093 4,09 4,093 4,093 4,093 4,09 4,097 5939605 11258760 17747138 24009618 26881901 6010953 5991125 17562102 17687953 27062109 22873459 Aire Fluoranthène 28