CR TP HEMOLYSE HEMATIES

COMPTE RENDU TP HÉMOLYSE

I. Introduction

Les cellules vivantes sont le siège d’échanges d’eau et de solutés ; ces échanges sont permis grâce à

la perméabilité de la membrane. Les échanges d’eau entre l’extérieur et l’intérieur de la cellule sont

permis grâce aux phénomènes d’osmose et de pression osmotique. L’eau se déplace toujours du

milieu le moins concentré en solutés vers le milieu qui en est le plus concentré. L’osmose est le

phénomène de diffusion entre deux solutions au travers d’une membrane semi-perméable tandis que

la pression osmotique est une force qui s’oppose à l’osmose pour prévenir l’éclatement de la cellule.

L’objectif de ce TP est d’étudier le comportement d’une hématie de rat lorsqu’elle est plongée dans

des solutions d’osmolarités différentes ou dans des solutions de même osmolarité mais de

compositions chimiques différentes. Les expériences réalisées au cours de ce TP permettent de

comprendre les notions d’iso-osmolarité, d’isotonicité d’une solution et la notion de résistance

globulaire. L’osmolarité est définie comme la mesure de la concentration d’une solution ; la tonicité

est une mesure de la pression osmotique et concerne le comportement de la membrane vis-à-vis des

différences de concentration entre deux solutions de concentrations différentes.

En outre, un globule rouge peut exister sous plusieurs formes : il est de forme biconcave en

conditions physiologiques, et peut être crénelé ou aplati dans un état pathologique.

Un globule rouge est normal en milieu isotonique, il est crénelé en milieu hypertonique et il est

turgescent en milieu hypotonique. Un milieu est iso-osmotique lorsque les compartiments

extracellulaire et intracellulaire sont de même concentration, un milieu est hypo-osmotique lorsque

le compartiment extracellulaire est plus concentré en eau que le milieu intracellulaire, enfin un

milieu est hyper-osmotique lorsque le compartiment extracellulaire est moins concentré en eau que

le milieu intracellulaire.

Les expériences testées permettent également de mettre en évidence les phénomènes de plasmolyse,

de turgescence et d’hémolyse.

II. Matériel et méthodes

Le matériel utilisé comprend des hématies de rat en suspension dans un sérum physiologique, une

solution mère de NaCl à 12‰, une solution de glucose à 5%, une solution d’urée iso-osmotique au

plasma, une solution de glycérol iso-osmotique au plasma, des tubes à essai, des tubes à hémolyse,

des pipettes graduées, des pipettes Pasteur, des lames et lamelles de verre, un microscope et une

centrifugeuse.

La première étape est la préparation des solutions de NaCl. Est mise à disposition une solution de

NaCl à 12‰. Les manipulations consistent à réaliser des dilutions de cette solution stock pour

préparer 8ml de solutions de NaCl à 9‰, 6‰ et 3‰. La réalisation de ces dilutions nécessite 2

tubes à essai dont l'un est rempli d’eau déminéralisée et l’autre avec de la solution de NaCl à 12‰ ;

cette manipulation est faite l’aide d’une pipette graduée.

Les calculs réalisés permettent de déterminer les quantités des différentes concentrations en NaCl et

d’eau à ajouter dans chaque tube à essai pour obtenir des solutions de 8ml. Les résultats sont

obtenus en utilisant la formule Ci.Vi=Cf.Vf.

Solution NaCl 9‰ = 6ml de NaCl 12‰ + 2ml d’eau

Solution NaCl 6‰ = 4ml de NaCl 12‰ + 4ml d’eau

Solution NaCl 3‰ = 2ml de NaCl 12‰ + 6ml d’eau

Au final il y a 8 tubes à essai notés de 1 à 8 :

- un tube de sérum physiologique = solution témoin

- un tube de NaCl 3‰

- un tube de NaCl 6‰

- un tube de NaCl 9‰

- un tube de NaCl 12‰

- un tube de glucose 5,5%

- un tube d’urée

- un tube de glycérol

À chaque tube est ajouté deux gouttes de suspension d’hématies. Cette première étape correspond à

une observation à l’oeil nu des solutions d’hématies. L’objectif de cette étape est de repérer les

tubes dans lesquels s’est produit une hémolyse. Les solutions d’hémoglobine dans lesquelles il n’y a

pas eu hémolyse sont troubles tandis que les solutions où il y a eu hémolyse sont roses et

transparentes.

La deuxième étape correspond à une observation microscopique des solutions. À l’aide d’une

pipette Pasteur, une goutte du contenu de chacun des tubes est déposée sur une lame recouverte

d’une lamelle. Chaque lame est ensuite observée au microscope à objectif x40. Ces observations

microscopiques permettent de déterminer les solutions où il y a eu hémolyse, plasmolyse ou

turgescence en fonction de la forme et de la taille des globules rouges. Dans la solution témoin les

cellules observées doivent être de forme biconcave, il y a hémolyse ou turgescence quand les

cellules sont éclatées ou gonflées, et plasmolyse quand les cellules sont aplaties.

La troisième étape correspond à une observation macroscopique après centrifugation des solutions.

La centrifugation des tubes est réalisée pendant 10 minutes à 3000 tours/minute. Elle est suivie

d’une nouvelle observation des tubes à l’oeil nu. Cette étape permet de vérifier que les tubes dans

lesquels une hémolyse est observée est en accord avec les observations obtenues précédemment.

L’étape de centrifugation permet également de préciser le taux d’hémolyse dans chaque tube. En

effet, l’hémolyse est totale si la solution est claire et transparente, elle est partielle si le culot du tube

est rouge foncé et que le surnageant est transparent, enfin, il n’y a pas hémolyse si la solution est

complètement trouble.

III. Résultats

• Calculs d’osmolarités :

Tube 2 : solution de NaCl 3‰

Solution de NaCl 3‰ correspond à 3g pour 1000ml d’eau.

Soit une concentration massique Cm = 3g/L

Concentration molaire [NaCl] : C = Cm/M = 3/58,5 = 51,3 mmol/L

NaCl se dissocie en 2 particules donc osmolarité = 51,3 x 2 = 102,6 mOsmol/L

Tube 3 : solution de NaCl 6‰

Solution de NaCl 6‰ correspond à 6g pour 1000ml d’eau.

Soit une concentration massique Cm = 6g/L

Concentration molaire [NaCl] : C = Cm/M = 6/58,5 = 102,6 mmol/L

NaCl se dissocie en 2 particules donc osmolarité = 102,6 x 2 = 205,2 mOsmol/L

Tube 4 : solution de NaCl 9‰

Solution de NaCl 9‰ correspond à 9g pour 1000ml d’eau.

Soit une concentration massique Cm = 9g/L

Concentration molaire [NaCl] : C = Cm/M = 9/58,5 = 153,8 mmol/L

NaCl se dissocie en 2 particules donc osmolarité = 153,8 x 2 = 307,6 mOsmol/L

Tube