La Chromatographie

membranes du RE contiennent aussi :

- les enzymes nécessaires à la synthèse des protéines, au métabolisme des lipides et au phénomène de détoxification.

- Le cytochrome p450, qui intervient dans les mécanismes de détoxification, est une protéine intrinsèque : son site actif se localise sur la face cytoplasmique, sa réduction se fait par p450 réductase qui est un cofacteur.

- Les enzymes intervenants dans le transfert des sucres sur les protéines : les glycotransférases (enzymes de glycosilation) situées sur la face luminale (=interne).

- Les enzymes intervenants dans la synthèse des stéroïdes et la biosynthèse des phospholipides (synthétisés dans le REL)

- La membrane du RE contient aussi des lipides : ils sont polyinsaturés. Le % de sphingomyéline est très bas, et il y a moins de cholestérol et de glycoprotéines que dans la membrane plasmique. Cela donne une plus grande fluidité aux membranes du RE.

ASSYMETRIE DE LA MEMBRANE

Des molécules glucidiques, des glycoprotéines et des glycolipides entrent en rapport avec la face luminale.

La glucose-6-phosphatase et la nucléotide-phosphatase sont des protéines de la face luminale.

Le cytochrome p450 est transmembranaire tandis que la cytochrome p450-réductase et la cytochrome b5-réductase sont situées sur la face cytosolique.

TRANSLOCATION DES PROTEINES NEOSYNTHETISEES DANS LA LUMIERE DU RE

(Concerne les protéines solubles)

Le complexe d’initiation, résultant de la fixation de l’ARNm sur la petite sous-unité du ribosome, se forme dans le cytoplasme à distance du RE. La grande sous-unité s’associe au complexe d’initiation et commence à synthétiser une protéine qui porte à son extrémité amino-terminale un signal peptidique hydrophobe d’adressage au RE.

Le signale peptidique est reconnu par une SRP (signal recognition particul). Il s’agit d’un complexe ribonucléoprotéique formé par l’ARN 7S associé à des protéines, et qui fait la navette entre mambrane du RE et le cytoplasme. Il s’associe au signal peptidique dés qu’il émerge de la grande sous-unité. La SRP se fixe alors sur le site A de la grande sous-unité et bloque temporairement la traduction jusqu’à ce que la grande sous-unité soit fixée sur le RE.

La SRP agit comme étiquette et permet à l’ensemble SRP/ribosome de s’unir au récepteur de la SRP, une protéine intrinsèque de la membrane du RE. Cette liaison est GTP-dépendante. Le ribosome se fixe par sa grande SU à un récepteur membranaire de RE : le récepteur du ribosome. La grande SU du ribosome repose alors sur un transporteur de protéine transmembranaire du RE : le translocon.

Le pore interne du translocon est aqueux : il est situé au dessous de la grande SU qui l’obture partiellement. Dés que le ribosome est fixé sur la membrane du RE, la SRP se sépare de la séquence signal (cette séparation nécessite l’union de GTP à une protéine G) et également du site A et du récepteur de la SRP. Cette séparation SRP/récepteur de la SRP autorise le début de la translocation (passage à travers la membrane du RE par le translocon). Elle dépend de l’hydrolyse de GTP lié.

L’extrémité 5’ de la molécule protéique en cours de synthèse se fixe sur un des éléments de la membrane du RE tandis que le peptide signal demeure dans le pore de translocation. L’élongation de la protéine et, probablement, une machinerie de translocation poussent la boucle protéique dans le RE au fur et à mesure que la biosynthèse progresse. La translocation est co-traductionnelle. (elles se déroulent en même temps) La translocation est ATP-dépendante.

A la fin de la traduction, le peptide signal est éliminé du pore de translocation mais demeure intramembranaire. Une peptidase sépare le peptide signal du reste de la molécule. Cette excision marque donc la fin de la synthèse et le début du transfert de la molécule protéique néoformée dans le RE. Les ribosomes se détachent de la membrane, leurs deux SU se séparent et gagnent un pool. Elles pourront éventuellement être utilisées pour de nouvelles synthèses. Les protéines synthétisées sont en général glycosilées au cours de la traduction : la glycosylation est co-traductionnelle.

DEVENIR DES PROTEINES INTRAMEMBRANAIRES

Certaine protéines élaborées par les ribosomes accolés au RE sont des protéines intramembranaires à traversée soit unique soit multiple.

Protéines à traversée unique

Les protéines à traversée unique en cours de synthèse possèdent un peptide signal N-term ou interne.

(Signal N-term : il joue le même rôle qu’avant mais la protéine est également porteuse d’un peptide de terminaison hydrophobe qui se fixe à l’intérieur de la membrane immédiatement après le clivage du peptide signal. Ce peptide de terminaison de transfert en forme d’hélice α demeure dans la membrane. Il se forme un segment transmembranaire porteur d’une extrémité C-term dans le cytosol et d’un extrémité N-term dans le lumière du RE.

( Lorsque le peptide signal est interne (cad compris dans la membrane), il est également reconnu par une SRP, le ribosome s’accole à son récepteur sur le RE et synthétise la protéine. Le peptide signal ne joue pas un rôle de terminaison de transfert. Il est signal d’initiation de transfert qui se lie à la protéine au cours de la translocation.

Si les acides aminés chargés + sont plus nombreux dans le segment qui précède le signal d’initiation (partie N-term), la protéine est insérée dans la membrane du RE de telle sorte que l’extrémité N-term est située dans le cytosol et C-term dans la lumière du RE.

Si les acides aminés chargés + sont surtout localisés après le signal d’initiation C-term, c’est C-term qui se situe dans le cytosol.

Protéines à traversée multiple

Les protéines à traversée multiple décrivent entre les segments intramembranaires des boucles alternativement dans le cytoplasme et la lumière. Ces protéines contiennent plusieurs peptides signal internes qui jouent le rôle d’initiateurs de transfert et alternativement en fonction de leur position, un rôle d’initiateur ou de terminaison de la translocation. Ces séquences peptides signal se succèdent tout au long de la molécule. La première séquence rencontrée initie la translocation, une boucle pénètre dans le REL au moment où la deuxième séquence passe dans le translocon, la translocation s’arrête, de telle sorte que le segment protéique qui lui succède reste dans le cytoplasme. Une troisième séquence agit comme activateur de translocation.

LA N-GLYCOSYLATION DES PROTEINES

Le RE l’assure. La glycosylation est l’ensemble des mécanismes qui assurent la transformation d’une protéine en une glycoprotéine. Dans la N-glycosylation, une seule espèce d’oligosaccharide composée de N-acétylglucosamine, de mannose et de glucose est transférée en bloc aux protéines du RE. Puisqu’il est toujours transféré au groupement NH2 sur la chaîne latérale d’un résidu asparagine de la protéine, on dit qu’il est N-lié à la protéine.

La glycosylation modifie la solubilité, la stabilité et la charge des protéines. Les groupes glucidiques des glycoprotéines servent de signaux de reconnaissance. Ils interviennent dans le ciblage des protéines et la reconnaissance d’autres protéines et d’autres cellules (le spermatozoïde reconnaît la membrane pellucide de l’ovocyte).

Le dolichol est un lipide polyizoprenoïde intramembranaire à chaîne carbonée très longue (C 95). Il est synthétisé dans le cytoplasme et inséré dans la membrane. La N-glycosylation débute par l’activation du dolichol par phosphorylation par l’ATP.

Le dolichol-phosphate est localisé à la surface cytosolique du RE : il se combine à deux résidus N-acétylglucosamines pour donner le N-acétylglucosamine-2pyrophosphoryl-dolichol.

Sur cette molécule, 5 résidus mannose s’accrochent successivement et constituent un (Man)5-N-acétylglucosamine-2pyrophosphoryl-dolichol. Cette molécule possède, grâce à ces additions de sucre, une arborisation sucrée qui s’épanouit sur la face cytoplasmique de la membrane du RE.

Le (Man)5-N-acétylglucosamine-2pyrophosphoryl-dolichol est ensuite réorienté vers la face luminale du RE par flip-flop.

Après réorientation, l’arborisation sucrée s’accroît encore par accrochage séquentiel de 4 résidus mannose puis 3 glucoses. Il se forme un intermédiaire complet : le (Glc)3-(Man)9-N-acétylglucosamine-2pyrophosphoryl-dolichol

Transfert des résidus sucrés sur la protéine

Le transfert se déroule en même temps que la protéine est synthétisée. L’arborisation sucrée est transférée du dolichol sur le polypeptide en cours de synthèse qui émerge de la membrane du RE dans la lumière grâce à une N-oligosaccharide-transferase. Ce transfert donne naissance à une glycoprotéine répondant à la formule (Glc)3-(Man)9-N-acétylglucosamine2-protéine.

La N-glycosylation s’achève dans l’appareil de Golgi.

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