Histo

soit HES.

Colorations spécifiques

On utilise parfois des techniques qui colorent de manière plus spécifique une molécule particulière. On peut par exemple mettre en évidence les structures riches en glucides, les structures contenant des acides nucléiques… En histologie on utilise notamment la coloration PAS (Periodic Acid – Schiff) qui permet de détecter les structures riches en glucides, comme le mucus ou un abondant glycocalyx (on parle de structures PAS positives).

On peut également révéler la présence d’enzymes en incubant la cellule avec une substance qui est modifiée par l’enzyme. Si le produit de la réaction est coloré et insoluble, les structures contenant l’enzyme deviennent visibles en microscopie.

Immunohistochimie

On peut enfin utiliser des anticorps pour localiser un antigène sur une coupe. Les anticorps sont des protéines de la famille des immunoglobulines qui reconnaissent spécifiquement une molécule, l’antigène, en se liant à différents épitopes. Les anticorps sont synthétisés par certains lymphocytes (lymphocytes B) en réponse à l’introduction d’une substance étrangère antigénique. L’introduction de l’antigène provoque la prolifération des lymphocytes B qui reconnaissent l’antigène (chacun de ces lymphocytes forme donc un clone) puis la synthèse d’anticorps. Les lymphocytes appartenant à un même clone synthétisent des anticorps qui reconnaissent tous le même épitope mais les anticorps issus de clones différents reconnaissent en principe des épitopes différents. Si l’on utilise directement le sérum de l’animal on aura donc un mélange d’anticorps reconnaissant les différents épitopes d’un antigène ; on parle d’anticorps polyclonal.

On peut également prélever les lymphocytes B de l’animal, les mettre en culture et les immortaliser puis réaliser un clonage. Chaque clone produit un anticorps qui reconnaît un seul épitope : on parle d’anticorps monoclonal. Les anticorps monoclonaux sont généralement plus spécifiques que les anticorps polyclonaux.

Dans les techniques directes, l’anticorps est chimiquement couplé avec un marqueur détectable en microscopie. Le marqueur peut être une enzyme ou bien une molécule fluorescente (fluorochrome). On applique l’anticorps sur la coupe et on laisse l’anticorps se fixer à l’antigène qu’il reconnait. On rince la coupe pour éliminer l’excès d’anticorps qui n’est pas fixé à l’antigène. Si l’anticorps est marqué par un fluorochrome, on peut observer la coupe à l’aide d’un microscope à épifluorescence. Ce microscope permet de former une image à partir des rayons qui sont ré-emis par les composés fluorescents présents dans l’échantillon. Si l’anticorps est couplé à une enzyme, on révèle sa présence par une réaction enzymohistologique. En microscopie électronique, on peut utiliser des anticorps couplés à des particules d’or.

Les techniques indirectes permettent de diminuer le nombre de couplages des anticorps à un marqueur. L’anticorps qui reconnaît l’antigène que l’on veut détecter (appelé anticorps primaire) n’est pas marqué. On applique cet anticorps sur la coupe puis on rince pour éliminer l’anticorps qui n’est pas fixé. Pour révéler le complexe antigène-anticorps, on utilise un deuxième anticorps (anticorps secondaire) qui reconnaît le premier anticorps; c’est l’anticorps secondaire qui est marqué. Par exemple, si le premier anticorps a été produit par