ETUDE DE LA CINÉTIQUE ENZYMATIQUE DE LA Β-GALACTOSIDASE.

Compte-rendu de TP d’Enzymologie

ETUDE DE LA CINETIQUE ENZYMATIQUE DE LA Β- GALACTOSIDASE.

Nassim AGUENI-Malek BOUROUROU| L3 BMC | 25-01-2019

Introduction :

Certaines protéines sont douées d’activité catalytique spécifique ; il s’agit des enzymes. Ils sont doués :

 Une spécificité d’action

 Une spécificité de substrat

 Un pouvoir catalytique qui est soumis à régulation

Rôle : Ils interviennent dans diverses réactions de dégradation, ou de synthèse

D’une manière plus générale, les protéines enzymatiques sont des catalyseurs qui en agissant à des faibles concentrations, elles augmentent la vitesse des réactions chimiques, sans en modifier le résultat. A la fin de la réaction, la structure de l’enzyme se retrouve inchangée. Le suivie de la catalyse homogène permet d’élucider en détail le comportement de l’enzyme et déterminer les paramètres cinétiques correspondants. Une enzyme donné est spécifique d’une réaction, c’est-à-dire qu’elle catalyse toujours la même transformation, se produisant sur les mêmes corps chimiques initiaux.

Le but du TP :

Le but de ce TP est d’étudier l’activité de la Β-GALACTOSIDASE lorsque l’on fait varier différents facteurs comme la concentration en substrat et sa nature, [enzyme] et la température. Aussi, de déterminer une valeur approchée de certains paramètres cinétiques.

Principes :

La Β-GALACTOSIDASE est une enzyme catalysant l’hydrolyse des β-D galactosides ou β-D galactopyranosides pour former des oses simples en fonction de la réaction. La réaction de la β-galactosidase est la suivante :

Au cours de ce TP, nous étudions l’influence de plusieurs facteurs sur la réaction enzymatique. On suit la réaction en dosant les produits qui apparaissent dans le milieu lorsque l’enzyme est mise en présence du substrat. Le substrat (ONPG), est incolore et donne, lorsqu’il est hydrolysé, du β-galactosidase en ortho-nitrophenyle (ONP), jaune en milieu alcalin, dosage directement par spectrophotométrie a 405nm. On fait alors une gamme étalon qui nous permet de connaitre la relation entre la quantité de ONP et de la DO, puis pour chaque étape du TP, on fait varier différents facteurs comme la concentration en substrat et sa nature, [enzyme] et la température. Aussi, de déterminer une valeur approchée de certains paramètres cinétiques.

I. Caractérisation d’une protéine

1. Spectre d’absorption

En mesurant l’absorbance de la solution d’enzyme à 1 mg/mL à plusieurs longueurs d’onde entre 220 et 320 nm, on a pu retracer le spectre d’absorption sur le spectrophotomètre.

Grâce à ce spectre, on a réussi à déterminer directement la longueur d’onde où l’absorbance est maximale (pic d’absorbance maximal).

On a donc λmax = 279.5 nm de DO max = 0.376.

2. Densité optique et concentration

On a préparé des solutions d’enzyme de concentrations différentes.

On a ensuite lu les absorbances à la longueur d’onde maximale déterminée précédemment,

soit 280 nm.

[E] mg/mL00,10,250,40,81DO28000.0470.0950.1480.2830.366

DO280=f([E]) :

On remarque que plus la concentration en enzyme augmente, plus l’absorbance est

importante.

3. Dosage des protéines selon Bradford

Selon la méthode de Bradford, on a déterminé la concentration de protéines par dosage colorimétriques.

Méthode : La solution de concentration connue permet de constituer une gamme étalon : série de tubes qui contiennent un volume identique mais des quantités croissantes et connues de la protéine de référence albumine sérique bovine (BSA).

En parallèle, une série de tubes, contenant différents volumes de prise d'essai de la protéine dont on veut déterminer la concentration (l'échantillon à doser), est préparée.

- Pour chacune des séries de tubes, on a lu les absorbances à 595 nm.

mBSA (µg)0246810X10µLX10µL’X50µLX50µL’DO (595nm)00,0950,1950,2740,3470,4310,0940,1070,6260,608

D’après la droite de tendance sur la courbe étalon, on obtient l’équation Y = 0,022x. On obtient donc la formule DO595nm= 0.022*concentration en protéines en µg/tube.

On cherche à déterminer la concentration en protéines dans une solution de BSA de concentration inconnue.

On a d’abord fait la manipulation avec 10 µL de solution de BSA X.

VolumeDOX=DO/0,022(µg/10µL)[c] en µg/µL[c] en µg/mlX10 µL0,0944,2727272730,427272727427,2727273X10 µL0,1074,8636363640,486363636486,3636364X50 µL0,62628,454545450,569090909569,0909091X50 µL0,60827,636363640,552727273552,7272727

On fait une moyenne des deux concentrations trouvées pour avoir une meilleure estimation de la vraie concentration :

- Pour le volume de 10 µL

[C1] = (427,27+486,36) / 2 = 456,81µg/mL

- Volume de 50 µL

[C2] = (569,09+552,72) /2 = 560,90µg/mL

Théoriquement, on devrait avoir la même concentration pour 10 et 50 µL de solution de BSA X.On fait donc une moyenne des deux valeurs trouvées.

La solution de BSA-X est donc pratiquement 5 fois plus concentrée que la solution d’albumine

de référence à 100 µg/mL.

II. Influence de la concentration en substrat et détermination

d’une vitesse initiale vi, de Vm et de Km

Ici on va chercher dans un premier temps à calculer l’activité d’une enzyme puis la constante de Michaelis et la vitesse d’une réaction enzymatique en utilisant l’ortho-nitrophenyl β-D galactose (ONPG) comme substrat. Ensuite, on utilisera également comme substrat le PNPG qui donne, après son hydrolyse par l’enzyme, du PNP.

Le PNP (ParaNitroPhénol) et le ONP sont jaunes en milieu alcalin. On peut donc suivre l'apparition du PNP et du ONP au cours de leurs hydrolyses en enregistrant l'absorbance du mélange réactionnel à 405 nm en fonction du temps. Enfin nous allons comparer comparer l’affinité de l’enzyme avec ces différents substrats.

A. PREMIERE METHODE

Dans cette méthode on effectue des prélèvements à des temps donnés dans différents milieux

d’incubation où la concentration en substrat varie.

Durant toute la méthode, on a mesuré les absorbances à 405 nm.

Gamme étalon :

On a réalisé avec le produit (ONP) qui se forme au cours de la réaction une gamme étalon en même temps que les tubes à essais sont préparés.

mONP (µg)020406080100DO (405nm)00,2130,4210,6620,8411.074DO405=f(mONP)

Essais :

On a préparé 6 tubes à essais (S1->S6), dont la concentration en substrat [ONPG] est croissante du 0.6 à 15(mg/tube). Ensuite, On a mis chaque milieu à incuber au bain-marie à 30°C durant toute la manipulation.

Après chaque prélèvement (toutes les 10 min pendant 50 min), la réaction a été bloquée grâce à du carbonate de sodium à 2M.

Résultats DO (405nm)Temps (min)01020304050S1

(0.6mg/tube)00,0630,1210,1630,1900,233S2

(1.5mg/tube)00,1510,2880,3420,4200,514S3 (3 mg/tube)00,2190,4440,6160,7780,970S4 (6mg/tube)00,3200,7200,9851.2931.611S5 (9mg/tube)00.3380,9551.3631,7172.206S6 (15mg/tube)00,6731.1461.5842.2192.675

DO=f(t) :

Exemple des calculs pour S2

Détermination de la concentration en substrat en mmol/L, il faut partir de la quantité d’ONPG que l’on a mis dans chaque tube.

Pour la solution S2, on avait 1.5mgONPG/tube.

Le volume du milieu d’incubation dans le tube était au final de 15 mL.

On réalise donc le produit en croix si dessous :

1.5 mg ---> 15 ml X= 100mg X < 1000 ml

[S2]