Exploration du métabolisme énergétique du muscle de l'Homme par RMN du phosphore-31

Compte Rendu

Exploration du métabolisme énergétique du muscle de l'Homme par RMN du phosphore-31

Introduction

        La résonance magnétique nucléaire (RMN) est une technique de diagnostic médical, très utilisée à ce jour, car elle permet de visualiser les différentes structures anatomiques de l'organisme. Cette technique a été découverte en 1946 avant d'être étendue à d'autres champs d'investigation au niveau biochimique chez l'Homme. C'est dans les années 80 qu'est appliquée la méthode du phosphore-31 au niveau musculaire lors de contractions chez l'Homme.

        Cette technique de S-RMN est non invasive et permet d'étudier tous les noyaux atomiques possédant un « spin ».

L'intérêt de la spectroscopie RMN in vivo du 31P réside dans le fait que ce noyau est le seul isotope naturel du phosphore qui dispose d'un signal particulièrement sensible au champ, ce qui permet de le détecter facilement. De plus, il nous permet de visualiser les composés contenant, au moins, un groupement phosphate ; ce qui est important puisque les molécules phosphorylées telles que l'ATP, le phosphate inorganique (Pi), la phosphocréatine (PC) ont un rôle clé dans le métabolisme énergétique du tissus musculaire.

Protocole expérimental

• Exploration S-RMN réalisée sur l'avant-bras

        Du fait de la présence d'un champ magnétique puissant, aucun objet métallique ne peut être disposé aux abords de l'appareil.

Le sujet assis, introduit son avant-bras dans l'appareil de RMN. Ce dernier est constitué :

– d'un aimant supraconducteur à l'origine de la production du champ B0 de 4,7 Tesla

– d'un émetteur-récepteur de radiofréquence à l'origine du champ B1 et capteur du signal FID (Free Induction Decay)

– un ordinateur est nécessaire pour la gestion du déroulement de l'expérience, mais également pour récupérer les informations  données par l'antenne accordée aux résonances du 31P et du proton. L'ordinateur permet de stocker les FID et d'effectuer par la suite, la transformation de Fourier de chacun des signaux afin d'obtenir les spectres RMN.

        Le bras est placé dans l’appareil de sorte que l’avant-bras soit au niveau de l’antenne doublement accordée aux résonances  du 31P et du proton. La main doit permettre aux doigts d'effectuer une série de flexions-extensions, en manipulant une sorte de poignée. Ainsi, l'utilisation de cette poignée permet de faire travailler le muscle de l'avant-bras.

        L'expérience débute par une période de quelques minutes permettant d'ajuster les paramètres d'acquisition du signal.  L'étape suivante consiste en la mesure du maximum d'intensité / de force nécessaire, à l'individu, pour effectuer le mouvement précédemment décrit.  

Après une période de repos de quelques minutes, une série d’exercices va être effectuée pour voir l’implication de métabolites essentiels dans le muscle, durant l'exercice et la phase de récupération, grâce à la détection du 31P.

La série d'exercices est une phase pendant laquelle le sujet réalise le mouvement de flexion-extension des doigts avec une évolution croissante de la force mise en jeu (7%, puis 15% et enfin 30% de la force maximale mesurée en début d'expérience),  pendant un certain temps et à répétition :

        – flexion pendant 6 secondes puis extension : répété pendant 2 min pour chaque intensité de force

L'expérience se clôture par une phase de récupération afin d'observer un retour aux conditions initiales.

        Nous avons effectué une expérience supplémentaire ayant pour but de mettre en évidence le rôle de l'oxygène dans la production d'ATP, à partir d'une consommation aérobie du glucose par les mitochondries. De ce fait, nous avons réalisé le même type d'expérience que précédemment mais en privant le muscle de dioxygène, via la présence d'un garot sur l'avant-bras.

La détermination du pH grâce à la S-RMN du 31P

        Dans les conditions d'une S-RMN in vivo du 31P, nous pouvons visualiser tous les composés phosphorylés ayant une concentration intramusculaire ou intracellulaire relativement importante. Ainsi, nous observons ce type de spectre dans le cas d'une série caractéristique de spectres de RMN du 31P enregistrés au cours du protocole repos-exercice-récupération du muscle sollicité :

[pic 1]

        Pour mesurer le pH dans les conditions physiologiques, et être sensible à de faibles variations, il faut utiliser un couple acido-basique dont le pKa est très proche du pH intracellulaire (pH ∼ 7). En effet, dans la zone du pKa, une petite variation de pH est reliée à une modification de l’équilibre chimique relativement importante et donc à un déplacement en fréquence qui peut être observable en spectroscopie RMN.

        En spectroscopie RMN du 31P, on utilise le couple acido-basique du Pi : H2PO4- / HPO42-  dont le pKa vaut 6.75. Ces deux formes : mono et bi-protonée sont liées entre elles par l'échange rapide d'un proton. C'est cet échange rapide qui est responsable de l'apparition d'un seul pic pour le Pi, et reflète alors l'équilibre entre l'acide et la base du couple impliqué. Pour calculer les variations de déplacement chimique de Pi, on utilisera comme référence le pic de la phosphocréatine. Cette molécule possède deux avantages : être insensible aux variations de pH (ce qui est une condition obligatoire pour servir de référence) et être la résonance la plus importante des spectres 31P.

        [pic 2]

        Le pH peut alors être déduit indirectement par mesure du déplacement du pic de Pi par rapport au pic de phosphocréatine (PC) entre les deux situations (repos-exercice) d'après la formule suivante :

pH = 6,75 + log (d-3,27) – log (5,69-d)

    où d représente le déplacement du pic Pi, exprimé en ppm et où δHPO42- = -5,69 ppm et δH2PO4- = -3,27 ppm

        En effet, la fréquence de résonance du couple acido-basique qui correspond à la moyenne pondérée des fréquences s'exprime en fonction de la fraction molaire et de la fréquence de résonance de HPO42-,  et de la fréquence de résonance de H2PO4-  :

ν = x (HPO42-) .ν (HPO42-) + (1 − x (HPO42-) ).ν (H2PO4-)

Par définition :

pH = pKa + log ( x (HPO42-) / (1 − x (HPO42-) )

En utilisant cette formule,  on peut exprimer le pH en fonction des fréquences de résonances :

 pH = pKa + log ( ν – ν (H2PO4-) / ν (HPO42-) − ν )

Et enfin en fonction du déplacement chimique :

pH = pKa + log ( δ – δ(H2PO4-) / δHPO42-− δ )

Analyse des résultats obtenus à la suite d'une expérience de S-RMN du 31P d'effort musculaire

Analyse de résultats théoriques