Immunofluorescence

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Introduction :

Détecter ou doser un antigène en présence de plusieurs protéines est possible grâce aux différentes  techniques tels que l’immunofluorescence, la cytometrie on flux. Leur principe repose sur l’utilisation d’un Ac primaire spécifique à un antigène. Puis à celui-ci est ajouté un Ac secondaire qui va se fixer à l’Ac primaire du fait de sa spécificité avec l’immunoglobine. L’Ac secondaire nous permettra alors de détecter la molécule fluorescente.  

Durant ce Tp, nous souhaitons visualiser et localiser les plaques d’adhérences focales avec la méthode d’immunofluorescence à partir d’une culture cellulaire. En effet, la matrice extracellulaire (MEC)  possède un ensemble de macromolécules qui assurent l’adhérence cellulaire. Quand la cellule adhère à une protéine de la matrice extracellulaire, celle-ci peut s’étaler et développer des zones de contact très localisées visibles par immunofluorescence. Les zones de contacts sont composées d’assemblage d’integrine qui se regroupe en amas.  Les integrines sont reliées aux protéines du cytosquelette qui sont eux même reliée au micro filament d’actine. En cas de contact avec la MEC, les intégrines deviennent actives et se regroupent en amas, ce qui par la suite active des molécules intracellulaires qui viennent se fixer sur l’intégrine. Les protéines associées au cytosquelette sont alors recrutées pour rejoindre le contact focal.

On utilisera au cours de notre étude des fibroblastes de souris NIH3T3 en condition stérile afin d’éviter une contamination. Pour l’expérience d’immunofluorescence, on réalisera une préparation de lames recouverte de fibronectine afin que nos cellules adhérents au support. La fibronectine est une protéine de la matrice extracellulaire. Elle présente des sites d’interactions avec des récepteurs membranaires de la famille des integrines.  Puis une préparation d’une suspension cellulaire de fibroblaste avec la déposition de la trypsine EDTA pour décoller nos cellules et celle de la DMEM qui a pour effet de stopper la réaction de la trypsine EDTA.

Egalement, nous procéderons pour nos deux techniques à un comptage de cellule avec  la lame, la plus répandu des laboratoires, celle de Malassez. Ceci nous apportera une information quantitative sur notre culture cellulaire.

L’utilisation du microscope inversé nous servira à examiner nos cellules afin de savoir si celles-ci sont adhérentes ou en suspension. Mais également de connaitre leur forme, soit arrondie, étalées…

L’objectif de notre seconde partie nous sert à déterminer quel récepteurs α4β1 ou α5β1 permet la liaison entre un fibroblaste à  la fibronectine. Chaque combinaison α/β détermine la spécificité  du récepteur de son ligand. On marquera notre suspension cellulaire par la présence d’anticorps dirigé contre les sous unités α4,α5 et β1. On réalisera un marquage direct pour les sous unités α car les anticorps utilisés sont liés à un fluorochrome comme FITC, Alexa 488 (vert) et un marquage indirect pour la sous unité β, c'est-à-dire avec l’utilisation d’un anticorps secondaire fluorescent.  Puis on analysera notre suspension cellulaire par la méthode de cytometrie en flux.

Des tests contrôles seront également faits en parallèle afin de verifier et confirmer nos résultats et donc de pouvoir déduire une conclusion sur la fixation non spécifique ou spécifique de l’anticorps.

Matériels et Méthodes :

Afin de réaliser une immunofluorescence, nous avons tout d’abord réalisé une culture cellulaire avec des fibroblastes de souris NIH3T3. Nous avons pour commencé préparer une lame contenant  deux dessins de spots : un pour le contrôle et un pour l’expérience. Nous les avons recouverts de 100µl d’une solution de fibronectine à 15µg/ml dans du PBS 1X pour que les cellules adhérentes puissent adhérer correctement. Et ensuite nous avons placé la lame dans une boite de pétri qui contient une petite boite d’eau afin d’éviter un phénomène d’évaporation et placer le tout à l’étuve à CO2 pendant 1heure. Pendant ce temps d’attente, nous nous sommes occupés en préparant une suspension cellulaire de fibroblaste. Pour cela, nous avons observé au microscope inversé l’aspect des cellules de notre flacon de culture. Lors de notre manipulation, toutes nos étapes on été faites sous la hotte, en condition stérile afin d’éviter une contamination et donc un faussement dans nos résultat.   Les cellules sont décollées  par une solution de trypsine EDTA. En effet, après avoir éliminé le milieu de culture, on lave nos cellules avec 5ml de PBS puis on dépose sur le tapis cellulaire  1ml de trypsine EDTA. La boite est placée à l’étuve 3 min à 37°C. Reobservation de la boite, toujours avec un microscope inversé, afin de vérifier que nos cellules se sont bien détachées. Puis ajout de 4ml de DMEM afin d’inhiber l’action de la trypsine. Immédiatement après, on homogénéise toute la surface de notre flacon de culture et on observe encore une fois au microscope pour revérifier. Ensuite, on transfert, la totalité de notre suspension dans un tube Falcon de 15ml.

Ensuite à l’étape de numérisation des cellules, on prélève 50 µl de la suspension cellulaire qu’on dépose au fond d’un tube eppendorf contenant 50 µl de bleu trypan. On monte ensuite la lame de Malassez et introduit 20 µl de notre mélange au bleu trypan, Puis comptage.

On récupère la lame de fibronectine précédemment mise à l’étuve, puis on élimine la solution de fibronective, on rince les spots avec 100µl de PBS et on dépose 100µl de la suspension cellulaire puis mise à l’étuve pendant 1heure. Pendant ce temps, on réensemence nos cellules avec 1.25ml de notre suspension cellulaire à laquelle on ajoute du milieu jusqu’à 1.5ml au total. Puis mise dans l’incubateur à 37°C pendant 4h.

Et durant cette attente de 4heure, on procède à notre marquage fluorescent. C'est-à-dire, qu’on récupère, une fois les 1 heure d’incubateur fait, notre lame avec les spots. On l’observe au microscope inversé afin de noter l’adhérence et l’étalement des cellules. Puis, on  procède comme plus haut au lavage des 2 spots avec 100 µl de PBS. Ensuite, on fixe nos cellules avec 100 µl de PBS-PFA 3%. Et on incube 5minutes. Puis on relave nos spots toujours avec 100 µl de PBS et celle fois ci on ajoute 100µl de PBS- triton et incubation 5minutes. On élimine le PBS triton et on lave deux fois le spot avec 100µl de PBS puis on dépose 100µl de PBS BSA et on incube toujours 5 minutes. Et une fois les 5 minutes écoulées, on introduit avec précaution sur un spot 50µl d’Ac I 4G10 avec la phalloidine et sur le spot contrôle 50µl d’IgG de souris. Puis on incube 20 minutes en protégeant de la lumière, à cause de l’excitation de la fluorescence. Ensuite, on élimine nos anticorps avec 3 lavages de 1 minute chacun en déposant 200µl de PBS à chaque fois. Puis sur les deux spots sont posés l’Ac II fluorescent anti IgG de souris couplé à l’Alexa 488. On incube 20 minutes toujours à l’abri. On élimine de la même façon que l’Ac I et on termine par  retirer  la totalité du PBS afin d’ajouter le mélange de PBS glycérol et le bleu Hoechst.

Cette fois ci notre lame est prête à être analyser au microscope à épifluorescence pourvu de filtre d’excitation à 350nm, 488nm et 595 nm.

Pour la partie de Cytometrie en flux, nous avons préparé une suspension cellulaire, comme lors de l’immunomarquage. Cependant, ici nous ne l’avons pas réalisé en condition stérile car les cellules que nous avons manipulées ne seront pas remises en culture.  Nous avons pour commencer enlevé le milieu de culture avec une P1000, puis laver le tapis cellulaire avec 10 ml de PBS. Une fois l’étape de lavage fait, nous avons déposé avec deux pipetages de 750µl de la trypsine EDTA. La trypsine EDTA nous sert à décoller les cellules adhérentes de leur support de culture et de les dissocier entre elles. La boite de fibroblaste est ensuite mise à l’étuve à 37°C durant 3 min. L’étape de vérification est alors réalisée grâce à l’observation de notre boite au microscope inversé. Une fois celle-ci décollée, on ajoute 4.5ml de DMEM afin d’inhiber l’action de la trypsine. Il ne faut pas oublier que durant toute notre manipulation, il faudra homogénéiser la suspension cellulaire par des aspirations – refoulement car celle-ci sédimente rapidement. On prélève alors 50 µl de notre suspension que l’on va déposer un fond de tube contenant 50 µl de bleu Trypan. En effet, nous allons procéder à la numérisation de nos cellules sur lame de Malassez. Pour cela nous déposons 20 µl de notre préparation Trypan/ suspension sur la lame et comptons nos cellules avec le microscope. La coloration au bleu Trypan va nous servir à colorer les cellules mortes et donc à faciliter notre comptage de cellule vivante / mortes. Une fois l’étape de comptage faite, nous procédons au marquage de celles-ci. On centrifuge nos suspensions cellulaires pendant 5 min à 1200t/min. On re suspend le culot dans 218.4 µl de PBS 2% de sérum veau fœtal car nous voulons une suspension de  cellules/ml. A partir de ce moment, toutes nos étapes seront réalisées sur glace afin d’éviter l’endocytose des cellules. On prépare 3 tubes : [pic 2]