Tillling

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Introduction

Une grande étape a été la prise de conscience, au XXe siècle, de la totipotence de la cellule végétale, c'est-à-dire de la possibilité qu’elle a de changer de fonction (une cellule de la tige, par exemple peut se transformer en cellule de racine). Cette particularité des végétaux est exploitée dans les techniques de culture in vitro qui permettent de reconstituer des plantes entières à partir de cellules.

Les techniques développées aujourd’hui dans un laboratoire d’amélioration des plantes donnent aussi les moyens de modifier le patrimoine héréditaire de la plante (ADN, support physique des gènes). La transgenèse qui permet l’introduction de gènes d’autres espèces dans le patrimoine génétique d’un organisme vivant (OGM) est la plus connue et la plus remise en cause. Cependant, d’autres méthodes ont été présentées :

La méthode TILLING (Identification des Lisions Induites localement dans le Génome) est une version moderne de la mutagenèse par rayonnement ou agents chimiques utilisée pour modifier de façon aléatoire les gènes d’une plante.

Partie I :

Notions de bases 

Avant de foncer dans l’explication de la technique TILLING, il faut mettre l’accent sur quelques notions de bases pour pouvoir comprendre le principe de cette biotechnologie.

L'information génétique dans la cellule est codée par l'ADN. Toutes les cellules d'un organisme donné possèdent la même quantité d'ADN, enroulé et compacté sous forme de chromosomes, groupés par paires chez les organismes diploïdes (animaux, végétaux…), et dont le nombre est particulier à une espèce donnée (23 paires chez l'homme).

La molécule d'ADN est constituée par un enchaînement de nucléotides ; ils sont constitués par un sucre, un groupement phosphate et quatre bases azotées différentes (A, T, G, C). L'enchaînement particulier de ces bases constitue l'information génétique, qui peut être transcrite puis traduite pour donner une protéine (voir fiches correspondantes). La portion d'ADN codant pour une protéine donnée est un gène. Le locus est l'endroit où se situe le gène sur le chromosome.

Le mot « génome » est la combinaison des mots « gène » et « chromosome ».

Génome :

 Ensemble de l’information génétique d’un organisme contenu dans chacune de ses cellules sous la forme de chromosomes. Le support matériel du génome est l’ADN, sauf chez certains virus où il s’agit d’ARN.

Gène :

 Fragment d’ADN contenant toutes les informations nécessaires pour produire un ARN ou, le plus souvent, une protéine. Un gène correspond à une instruction à effectuer par la cellule.

Chromosome :

 Élément constitutif du génome, composé d’une longue molécule d’ADN. Le génome humain est constitué de 46 chromosomes (23 paires).

 Les allèles et les mutations

Les informations génétiques codées au niveau d'un même gène peuvent être différentes. Les différentes formes possibles d'un gène donné sont appelées les allèles. Cette diversité est rendue possible par la structure même des allèles. Ces derniers ne sont en effet que des séquences de nucléotides susceptibles d'être modifiées. Au niveau du seul nucléotide, on peut en effet déjà énoncer trois types de mutations possibles :

• On remplace un nucléotide de la chaîne par un autre : substitution

• On enlève un nucléotide de la chaîne : délétion

• On ajoute un nucléotide à la chaîne : insertion

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Figure 1 Les types de mutations possibles dans un nucléotide

La mutagénèse est aussi une technique essentielle pour l’étude de gènes spécifiques. Elle permet de d’obtenir une multitude d’informations dont le rôle et la fonction d’un gène.

Les agents mutagènes

Les causes des mutations se répartissent en 4 grandes catégories :

• Les substances chimiques : Elle sont très diverse on peut citer les agents alkylants (éthylméthane et sulfonate), les agents désaminant (acide nitreux et bisulfite) et les analogues des nucléotides (5-bromouracile, 2 amino purine, les acridines, l’aflatoxine B1).

• La chaleur.

• Les rayons ultra violets.

• Les radiations ionisantes : rayons X, rayons γ,…..  

Phénotype et génotype

L'ensemble des allèles détenus par un individu constitue le génotype. Celui-ci reste avant tout une donnée génétique. En vis-à-vis de celui-ci, on place généralement le phénotype (ensemble des caractères observables d'un individu, par exemple la couleur des yeux).

Lésion

Une lésion désigne toute altération des caractères anatomiques ou histologiques d'un organe, qui se trouve alors dans un état anormal. Ces altérations peuvent être à l'origine d'un dysfonctionnement de l'organe touché.

Partie II :

TILLING TECHNOLOGY

Le TILLING (Targeting Induced Local Lesions in Genomes) est une technique permettant de caractériser et d’utiliser la diversité génétique en identifiant des mutations induites localement dans le génome.

Elle consiste à provoquer des mutations aléatoires physiques ou chimiques sur un gène étudié (séquence connue, fonction non connue mais soupçonnée). Des enzymes capables de reconnaître spécifiquement des défauts d’appariement et de couper le gène étudié à certains endroits bien précis permettent d’isoler des plantes mutantes potentiellement intéressantes. Les chercheurs peuvent alors étudier le phénotype de chaque plante mutante et confirmer ou déterminer ainsi la fonction du gène.

La technique dite de « TILLING » a déjà été utilisée avec succès dans le cas de la tomate, du blé, du pois, du colza… Ainsi, certaines mutations repérées chez les solanacées ont permis de confirmer qu’une altération spécifique d’un gène permettait d’induire la résistance à une famille de virus (potyvirus) en bloquant la formation d’une protéine utilisée par le virus dans son cycle infectieux. L’utilisation du TILLING permet alors de repérer et de sélectionner des plantes résistantes à ce virus.

Principe

La génération objet de notre étude sera nommé M0 étant la génération zéro.

1. Collection de mutants EMS

C’est une sorte d’alimentation d’individus sur milieu artificiel contenant de l’EMS puis mise en collection des descendants (lignées « mutantes »).

L’EMS étant le méthanesulfonate d'éthyle est un composé organique mutagène, tératogénique et présumé cancérogène, de formule CH3SO3C2H5. Il produit des mutations génétiques aléatoires par substitution de nucléotides. Le groupement éthyle de l'EMS réagit avec la guanine de l'ADN, formant une base anormale O-6-éthylguanine. Durant la réplication de l'ADN, l'ADN polymérase apparie fréquemment une thymine à la place d'une cytosine en complément de la O-6-éthylguanine. À la suite d'une série de réplications de l'ADN, la paire de base originale G:C peut donc devenir A:T. Ces changements dans l'information génétique sont souvent néfastes pour la cellule et peuvent induire l'apparition d'une maladie. L'EMS est souvent utilisé en génétique comme agent mutagène. Les mutations génétiques induites peuvent être analysées par séquençage de l'ADN ou par d'autres techniques.

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Figure 2 La mutagenèse EMS

Un échantillon de graines est mutagénéisé avec le mutagène EMS (ethyl methonyl sulfate), qui génère des mutations ponctuelles de façon aléatoire le long du génome. Les graines traitées sont mises à germer et les plantes M1 obtenues autofécondées.

Cette génération mise en contact avec l’EMS sera nommée M1 donnant des graines qu’on va mettre en culture pour avoir une génération M2 qui va subir les étapes qui suivent.

1. Collection d’ADN et pooling des familles M2

En seconde génération, une plante M2 est issue de chaque plante M1. Les graines M3 récoltées sur ces plantes sont stockées et des prélèvements foliaires permettent de réaliser une collection d’ADN. Les ADNs sont regroupés en pools de profondeur et de dimension variables en fonction du système de détection de SNP utilisé.

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Figure 3 Pooling des ADNS de la famille M2

1. Gène candidat : amplification par PCR de la région d’intérêt

Pour réaliser un criblage de type « enzymatique », des sondes spécifiques pour le gène d’intérêt sont utilisées pour amplifier par PCR les séquences correspondantes présentes dans chaque pool.

La PCR ou Polymérase Chain Reaction conduit à l'amplification in-vitro de plusieurs millions de fois une séquence spécifique d'acide nucléique qui peut être minoritaire voir très rare (10-2pg). Elle exploite le processus de la réplication et fait appel, pour cela, sur la capacité de l'ADN polymérase à synthétiser le brin complémentaire d'un ADN servant de matrice. Pour initier le processus, des amorces (ou primer) s'hybrident de part et d'autre de la séquence à amplifier. Cette configuration permet à l'ADN polymérase de répliquer les 2 monobrins dans le sens 5' vers 3' et ainsi aboutir à la synthèse de nouveaux ADN doubles brins.

La PCR s'effectue sur 3 étapes:

• La dénaturation thermique de l'ADN: à 95°C, les liaisons d'hydrogènes sont rompues et les 2 brins de l'ADN se séparent. L'ADN passe sous forme simple brin dans le milieu.

• Hybridation des amorces: le milieu réactionnel contient 2 amorces, chacune complémentaire d'un des 2 brins. La température permettant la fixation des amorces sur les monobrins d'ADN est comprise entre 50°C et 65°C. Les amorces en larges excès, s'hybrident dès lors qu'elles rencontrent les séquences complémentaires.
• Extention des amorces: intervention de la taq polymérase (ADN polymérase) qui allonge les amorces en y incorporant les désoxyribonucléiques complémentaires de la séquence de la matrice auquel elle est hybridée. Cette étape s'effectue à une température de 72°C.

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Figure 4 Processus d'amplification au niveau du gène par PCR

• Au deuxième cycle:

 La quantité d'ADN continue de doubler et les premiers brins dont la taille est limitée par les 2 amorces font leur apparition.