RNAseq

RNA-Seq

Qu’est ce que c’est ?

Le séquençage de l’ARN ou RNA Seq est une technique récente qui fait partie du « séquençage à haut débit » ou aussi appelé « séquençage de nouvelle génération » . Cette méthode permet d'identifier et de quantifier l’ARN présent dans un échantillon biologique à un moment donné, grâce à l’analyse du transcriptome cellulaire.

En effet, le transcriptome d'une cellule, correspond à l'ensemble de tous les transcrits d’ARN (codant et non codant).

Le séquençage à haut débit permet la lecture complète de l’ARN de la cellule (ARNm, ARNt, micro ARN) ce qui facilite la compréhension des mécanismes d'épissage alternatif de gènes notamment les modifications post transcriptionnelles, le polymorphisme nucléotidique (SNP) etc.

L’RNA-Seq est également utilisé pour déterminer les marges exons/introns des gènes mais aussi vérifier la localisation des extrémités 5’ et 3’ du gène.

La RNA-seq nous a donc permis de comprendre l'activité des gènes, leur niveau de transcription et de façon générale de comprendre la biologie d’une cellule et ainsi pouvoir évaluer les changements qui peuvent montrer la présence d’une maladie.

Cette techniques comprend 3 étapes :

1 - L’Extraction de l’ARN à partir de tissus organiques. Les ARN que l’on étudie avec cette méthode sont matures. C’est un point important, car si l’on utilise des ARN non matures, ils ont tendance à être rapidement dégradés.

2 - Synthèse d’une bibliothèque d’ADNc : Une fois l’ARNm isolé, ce dernier doit être converti en ADNc simple brin par l'utilisation d'une reverse transcriptase (ADN polymérase ARN dépendante).

Puis en ADNc double brin via l’ADN polymérase Taq normale.

L'ADNc est ensuite fragmenté et des adaptateurs sont ajoutés à chacune des extrémités des fragments.

Ces adaptateurs jouent un rôle dans le bon fonctionnement du séquençage car ils contiennent notamment des éléments fonctionnels tels que des éléments d'amplification et le site primaire d'amorçage du séquençage.

Ces ADNc sont ensuite amplifiés et sélectionnés en fonction de leur taille. Il y a également des contrôles de qualité. Tout cela participe à la formation d’une banque d'ADNc.

3 - Séquençage de l’ADNc :

La banque d'ADNc obtenue doit alors être analysée par NGS sur ordinateur via l'utilisation de différentes plateformes développées par Illumina, Oxford Nanopore Technologies etc.

Cette analyse permet