Purification De La Ldh

'acide oxamique va créer avec l'enzyme une liaison covalente beaucoup plus forte que celle créée avec le bleu Cibacron. On extrait ainsi du gel la LDH. On fait donc trois élutions pour obtenir trois fractions E1, E2 et E3.

On mesure ensuite la variation d'absorbance au spectrophotomètre de toutes les fractions à 340nm. Cette mesure ce fait à 340 nm car à cette longueur d’onde seul le NADH absorbe et non le NAD⁺ (les deux absorbent à 260nm). Courbes p.

On constate que seuls les fractions E1, E2 et de départ ont une variation d'absorbance sur les courbes ▵Abs=f(min). Tandis que les fractions non retenues et de lavage ne varient pas.

Ces mesures servaient à mesurer l'absorbance du NADH, liée à l'oxydation du lactate. Ce qui veut dire que les fractions E1, E2 et de départ ont oxydé le lactate donc utilisé de la LDH et formé du NADH contrairement aux autres fractions.

Calculs :

La pente de la courbe en E1 correspond à la Vi, vitesse initiale de E1 :

• 8,6cm = 0,43DO et 3,1cm = 0,52min soit la vitesses initiale correspond au DO/min donc :

pente = 0,43/0,52 = 0,827 DO/min

Vi = 0,827 DO/min

• d'après Beer-Lambert DO=lC soit :

pente = ▵DO/▵t = l▵C/▵t

soit ▵C/▵t = pente/l (=6,22.10³M⁻¹/cm ; l = 1cm)

donc Vi = (0,827/6,22.10³)*10⁶*10⁻³

(10⁶→µmoles ; 10⁻³→ mL)

Vi = 1,33 µmoles/min

On trouve pour la fraction de départ :

Vi = 0,585 DO/min = 9,4.10⁻² µmoles/min

Et pour E2 :

Vi = 0,045 DO/min = 7,2.10⁻³ µmoles/min

Pour le reste (E3, fraction lavage, fraction non retenue) :

Vi ≈ 0 µmoles/min

Électrophorèses :

C1 : p.

Une électrophorèse des fractions brute et purifiée a été effectuée.

• On constate que sur la fraction brute, on obtient plusieurs tâches. Selon leurs masse, les protéines n'ont pas migré au même endroit et donc il y a différentes protéines présentes dans la fraction brute. Ce qui est logique car cette fraction provient d'un extrait de tissu animal. La LDH n'est pas encore isolée et purifiée.

• La fraction purifiée, comme son nom l'indique, est purifiée et donc on devrait retrouver seulement la LDH qui est la protéine étudiée. Or on sait que la protéine étudiée, est constituée de quatre sous-unités mais que ses sous-unités sont toutes de 35 kDa. Elles devraient donc migrer toutes au même endroit lors de l'électrophorèse dénaturante.

Mais on obtient deux tâches lors de cette électrophorèse, une vers 66kDa et une vers 35kDa. Notre fraction n'est donc pas totalement isolée du reste des protéines et il reste encore une protéine inconnu dans notre échantillon.

Cela s'explique par la méthode utilisée pour purifier la protéine, le bleu Cibacron est spécifique à un groupe de protéines et non seulement à la LDH.

C2 : p.

Une électrophorèse non dénaturante est effectuée pour séparée les isoenzymes de la LDH : H, M₃H, M₂H₂, MH₃, M₄.

Le monomère H étant le plus chargé négativement à pH neutre et alcalin, leur séparation est alors possible. On obtient alors 5 formes d'isoenzymes tétramériques.

L'électrophorèse nous montre 5 tâches, donc 5 protéines différentes. Nous avons donc bien toutes les isoenzymes.

On constate que la plus petite tâche chez les hybrides correspond à l'isoenzyme M₄ c'est-à-dire l'enzyme de muscle. On a ici plus d'isoenzyme H₄ que M₄ (plus les isoenzymes intermédiaires).

On peut émettre l'hypothèse que l'extrait utilisé pour cette manipulation provient de muscle cardiaque.

Dosage des protéines :

On utilise ensuite la méthode colorimétrie de Bradford. Elle utilise le réactif de Pierce. Cette colorimétrie repose sur la fixation non covalence du Bleu de Comassie sur les protéines.

On effectue tout d'abord une gamme étalon avec une solution albumine de concentration connue.

Ensuite, on mesure les DO de la gamme étalon correspondant à des quantités de protéines.

Enfin on dose nos fractions pour déterminer la concentration de protéines de celles-ci.

Courbe p.

Calculs :

• extrait dilué au 1/20 :

⁃ on ajoute 10µL d'extrait dans la cuve pour un volume total de 1mL. L'absorbance lue est de 0,330.

Par lecture sur la courbe on obtient 4,2