Tp Purification De La Thrombine

nt des propriétés pro-inflammatoires telles que la production de prostaglandines, du facteur d'activation plaquettaire (PAF) ou l'expression de la P-sélectine.

La thrombine interagit avec des inhibiteurs comme :

- La thrombomoduline, qui liée à la thrombine forme un complexe anticoagulant.

- L'antithrombine, qui est une serpine et inhibe (serine protease inhibitor) qui inhibe la thrombine : après que le site actif de la thrombine ait scindé le site enzymatique de l'antithrombine la sérine active de l’enzyme et l’arginine du site réactif de l’AT III vont être liés de manière covalente par une liaison ester. Le complexe ainsi formé est inactif.

- l'héparine : qui se fixe sur l'antithrombine et accélère d'environ 1000 fois la vitesse d'inactivation des enzymes de la coagulation.

L’activation de la prothrombine est calcium dépendante. Dans ce tp les ions barium vont mimer l’action des ions calcium. Le clivage de la prothrombine en thrombine sera réalisé avec de l’écarine qui est un venin de serpent.

Dans ce TP nous allons donc chercher à isoler (purifier) la prothrombine en deux étapes : par précipitation au BaCl2 où la thrombine sera saturée par le chlorure de barium, puis par chromatographie échangeuse d'ion en se servant de l’électronégativité de la protéine. Nous allons ensuite essayer de déterminer l'activité enzymatique de la prothrombine transformé en thrombine, sous l'action de l'écarine et grâce à un substrat chromogénique.

Sources : Wikipédia : http://fr.wikipedia.org/wiki/Prothrombine

III . Les méthodes

1) Centrifugation :

Les échantillons sont soumis à de fortes accélérations qui permettent le fractionnement des constituants en un sédiment le culot et en un surnageant.

2) Précipitations au Chlorure de Baryum (BaCl2) :

La prothrombine fixe les ions calciums. Dans ce tp nous utiliserons les ions bariums qui miment les effets des ions calciums en ajoutant un avantage, celui d’être moins soluble que les ions calcium et permettent donc une meilleure précipitation des protéines. L’ajout des ions chlore permet d’éliminer les autres protéases qui utilisent le Ca²+.

Première précipitation : ajout du BaCl2 dans un aliquot de plasma se fait goutte à goutte pour permettre à toutes les molécules de prothrombine d’être au contact des ions baryum. La prothrombine va s’entourer de BaCl2 au détriment des molécules d’eau et devenir insoluble. Après centrifugation nous pourrons récupérer le surnageant et le culot.

Seconde précipitation sur le culot reprécipité permet d’obtenir un meilleur résultat lors de la mesure de l’activité.

Après chaque ajout de BaCl2 et centrifugation une partie du surnageant sera prélevé ( S1 , S2) et le culot sera resuspendu dans une solution saline avant d'être réprécipité à nouveau ( C1 , C2 ). Dans C2 on rajoute l’EDTA qui est un puissant chélateur utilisé pour récupérer les ions Ba2+ et permettre la resolubilisation des protéines en accélérant les réactions d’oxydation.

3) Dialyse : (non réalisée au cours du tp)

* Etape de filtration : retient l’EDTA et les ions barium et laisse passer les protéines de petite taille

On recupère donc la thrombine

Maintenant on doit séparer les protéines avec du sulfate d’ammonium :

* Etape de purification : fractionnement avec le sulfate d’ammonium qui dépend de la solubilisation propre de chaque protéine par sa composition en acide aminé. Le sulfate d’ammonium est un sel très soluble en solution aqueuse mais reste sous forme cristalline. Il est très hydrophile et compétitionne efficacement avec les protéines pour l’eau causant leur déshydratation. Il est utilisé pour précipiter les protéines en fonction de leur hydrophobicité. Pour la prothrombine, sa limite de solubilisation est de 60% au sulfate d’ammonium.

* Deuxième dialyse pour éliminer le sulfate d’ammonuim.

Exemple d’une représentation shématique de dialyse ne laissant pas passer entre autres les GR

4) Chromatographie par échange d’ions :

Le but est de récupérer des molécules de charge opposée à celles qui sont sur la colonne. La thrombine étant chargée négativement la résine de la colonne est chargée positivement. Un premier lavage au trisodium-citrate seul permet d’éliminer les protéines qui ne se sont pas fixées. Les protéines fixées à la colonne n’ont pas toutes la même négativité. On réalise un gradient de NaCl qui va permettre de décrocher la thrombine. On mesure ensuite successivement les densités optiques associées.

Etapes de la chromatographie par échange d’ions

5) Spectrométrie

On réalise un test d'activité. C'est un test enzymatique de la prothrombine en utilisant un substrat chromogénique. Ce test permet de déterminer s'il y a présence ou non de prothrombine.Elle est basée sur la présence d'un substrat qui ressemble au substrat naturel de la thrombine. En présence de thrombine, ce substrat est clivé ce qui entraîne une coloration révélée à la fluorescence. Pour réaliser cette mesure, il faut diluer la solution que l'on veut étudier, y ajouter de l'écarine, du tampon d'activité et du substrat chromogénique. L’écarine, extraite du venin de serpent, transforme la prothrombine et thrombine. Elle permet la coagulation du sang.

On mesure ensuite directement l'activité grâce à un spectrophotomètre. Cet appareil mesure la densité optique. L'absorbance d'une solution sera proportionnelle à la concentration de la substance en solution, à condition de se placer à la longueur d'onde à laquelle cette substance absorbe les rayons lumineux ( pour déterminer le pic de prothrombine : 280nm).

IV. Résultats

1) Précipitation au Bacl2

Graphique n°1 : test enzymatique de la première précipitation avec C1, S1 et PL

On peut observer sur ce graphique que la courbe noir correspondant à S1 est quasi nulle et constante tout le long de l'activité enzymatique. Celle de C1, bleue est une courbe croissante de pente 8,3e-4 .Enfin celle de PL est aussi croissante avec une pente de 6e-4.

Graphique n°2 : test enzymatique de la deuxième précipitation avec C2 et S2

On peut remarquer que la courbe C2 ressemble à celle de C1 avec une pente inférieure à celle de C1 (9e-5). Et que la courbe S2 ressemble également à S1.

| NaCl non dilué |

Pente | 0,01 |

Facteur de dilution | 1/14 |

Activité enzymatique | 0,01 / 14 = 7,1429e-4 |

rendement | 7,1429e-4 / 8,3e-4 = 86,06 % |

Graphique 3 : Pente de la courbe du NaCl non dilué déterminée grâce à une courbe de tendance sur le graphe suivant

Graphique N° 4 : Résultat avec utilisation du NaCl dilué

Tableau de résultats obtenus lors de la mesure de la Do à 280 nm des différentes fractions recueillies

Fraction n° | Absorbance | Concentration Nacl |

| | |

1 | 0,07 | 0,25 |

2 | 0,08 | 0,375 |

3 | 0,09 | 0,4375 |

4 | 0,102 | 0,46875 |

5 | 0,094 | 0,484375 |

6 | 0,16 | 0,4921875 |

7 | 0,195 | 0,49609375 |

8 | 0,335 | 0,498046875 |

9 | 0,433 | 0,499023438 |

10 | 0,278 | 0,499511719 |

11 | 0,189 | 0,499755859 |

12 | 0,152 | 0,49987793 |

13 | 0,061 | 0,499938965 |

14 | 0,043 | 0,499969482 |

15 | 0,029 | 0,499984741 |

V.Discussion

Graphique n°1 : test enzymatique de la première précipitation avec C1, S1 et PL

La courbe noir correspondant à l'activité enzymatique du surnageant dilué est quasiment nulle, ce qui parait normal étant donné qu'il n'y a quasiment plus de Prothrombine dans le surnageant : il n'y a pas formation de Thrombine.

- La courbe rouge correspond à l'activité enzymatique de la Prothrombine contenue dans le plasma dilué : la courbe montre qu'il