Rapport Phosphatase Alcaline bcm1521

Introduction

Une réaction enzymatique est un ensemble de réactions chimiques catalysées par des enzymes. L’enzyme qui a été utilisée lors de cette expérience est la phosphatase alcaline. Elle peut déphosphoryler plusieurs molécules comme l’ADN ou les protéines. Le para-nitrophénylphosphate (pnPP) est le substrat avec lequel on sera en mesure de suivre l’avancement de la réaction. Lorsque le pnPP est déphosphorylé, ceci va produire du paranitrophénol (pNP), qui se caractérise d’un composé de couleur jaune, qu’on pourra suivre l’apparition avec une mesure d’absorption de 400 nm. La réaction général de la réaction à l’étude est : monoester o-phosphorique + H2O  Alcool + H3PO4.

Certains paramètres cinétiques sont responsables de varier la vitesse de la réaction. Ces paramètres sont la concentration d’enzyme, la température, le pH et la concentration en substrat et d’un inhibiteur. Afin d’étudier l’effet de l’augmentation de la concentration enzymatique sur la vitesse, le substrat doit être présent en quantité excessive. Quand le substrat est en excès, la vitesse augmente avec la concentration de l’enzyme. S’il n’est pas en excès, il sera complètement hydrolysé par une quantité plus faible d’enzyme et donc ajouter plus d’enzyme n’augmentera pas la vitesse. Par la suite, le pH a une influence sur l’activité enzymatique. En effet, chaque enzyme a son pH optimal où l’activité est maximale. L’enzyme utilisée a un pH optimal basique. Avec une quantité de substrat non limitante, on sera en mesure d’avoir les conditions idéales pour observer la vitesse de la réaction qui dépend du pH ou la température. Puis, pour l’effet de la concentration du substrat, plus qu’elle augmente, plus la réaction enzymatique est rapide. Par contre, cette affirmation est vraie tant qu’on n’a pas dépassée une certaine concentration en substrat dite limitante. Cette dernière est atteinte lorsqu’on ajoute du substrat, mais la vitesse n’augmente plus.

La représentation de Michaelis-Menten est un graphique qui représente la vitesse initiale en fonction de la concentration du substrat. Les vitesses mesurées croissent en fonction des concentrations du substrat. La relation n’est pas linéaire, mais une hyperbole. Un but de dessiner ce graphique est de déterminer la vitesse maximale soit Vmax. Avec cette valeur, on peut trouver le Vmax/2 et de ce fait trouver le Km. Le Km est la constante de Michaelis. Cette constante est exprimée en mol/L (M). Elle signifie la concentration en substrat nécessaire pour atteindre la moitié de la vitesse maximale lors de la réaction. Il représente l’affinité de l’enzyme pour le substrat en absence d’inhibiteur. L’information qu’on peut tirer du Km est que s’il est élevé, c’est qu’une concentration élevée en substrat est nécessaire pour atteindre la moitié de la vitesse maximale de réaction. De ce fait, l’enzyme a donc une affinité assez faible pour le substrat. Le même raisonnement peut être fait pour un Km faible. Une petite concentration de substrat est nécessaire pour hydrolyser la moitié des sites catalytiques de l’enzyme. En effet, le Km peut être dit comme étant inversement proportionnel à l’affinité de l’enzyme pour le substrat. Lorsque Km est faible, cela peut se traduire par le fait que l’enzyme peut déphosphoryler de façon efficace et ce même en faible concentration de substrat. De plus, lorsque Km est élevé, cela peut être dû au fait qu’un substrat n’est pas le substrat naturel d’une enzyme, par exemple qu’il y a une grande quantités de substrat dans l’environnement de l’enzyme ou que l’enzyme peut prendre en charge une grande quantités de substrat et possède donc une spécificité moins élevée. Pour le graphique de Lineweaver Burk, c’est une représentation linéaire des mêmes deux variables utilisés dans le graphique précédent, mais ils sont inversés. Le Ki représente l’affinité de l’enzyme pour l’inhibiteur.

Pour ajouter, les effets d’un inhibiteur sont également observés. Il y a trois types d’inhibiteurs soit : compétitifs, incompétitifs et non-compétitifs. Chacun a un effet et non effet sur Vm et Km. Pour l’inhibiteur compétitif, il entre en compétition avec le substrat pour se fixer sur le site actif de l’enzyme. Cette compétition va empêcher la liaison enzyme-substrat. Par contre, si le substrat se fixe avec l’enzyme, la réaction se déroule normalement. L’inhibiteur compétitif est observé lorsque le Vm n’est pas modifié et que le Km augmente. Quant à l’inhibiteur incompétitif, il se lie au complexe Enzyme-Substrat mais pas à l’enzyme libre. Il est observé quand le Vm et le Km diminuent. Puis pour l’inhibiteur non-compétitif, il se lie à l’enzyme libre de même qu’au complexe Enzyme-Substrat, ce qui sera noté par un Km constant et un Vm qui diminue. Lors de cette expérience, l’effet de l’inhibition de la réaction entre la phosphatase alcaline et le pnPP par le phosphatase inorganique.

L’expérience nous permettra de déterminer les effets de ces paramètres cinétiques de la déphosphorylation du pnPP en pNP par l’enzyme phosphatase alcaline. Selon la théorie, l’augmentation de la concentration de l’enzyme devrait faire augmenter la vitesse de la réaction. De plus, le graphique obtenu à l’aide du pH devrait avoir la forme d’une parabole où le pique serait le pH optimal. Pour ajouter, avec le graphique de Michaelis-Menten, devrait on sera en mesure de déterminer la nature de l’inhibiteur avec les différents Vmax et Km obtenus.

Méthodes et matériels

Courbe d’étalonnage du pNP

Des concentrations de 0, 5, 10, 20, 30, 40 et 50 uM de pNP sont placées dans des cuvettes de 1.5 mL et mélangées. Elles sont par la suite mesurées dans le spectrophotomètre à 400 nm, pour ensuite tracer la courbe avec les résultats obtenus..

Effet de la concentration d’enzyme sur la vitesse de la réaction

12 cuvettes sont préparées, dont 6 contiendront le tampon Tris 0.75M pH 10.25 et les 6 autres le NaOH 1 M avec respectivement 916, 900, 866, 833, 800 et 766 µL. Dans chacune des cuvettes sont ajoutées 67 µL de pNPP 0.18 M. Puis, avant de mesurer l’absorbance à 400 nm à intervalles de 30 secondes durant 5 minutes, sont ajoutés des concentrations de 17, 33, 67, 100, 133 et 167 µM dans les cuvettes. Un graphiques est ensuite tracé avec les résultats obtenus.

Effet du pH sur la vitesse de la réaction

Le blanc est préparé en ajoutant 533 µL de tampon Tris 0.75 pH 10.25, 333 µL de NaOH 5N, 33 µL de phosphatase alcaline et 100 µL de pNPP 0.18 M. Dans 9 cuvettes sont ajoutées 533 µL de tampon Tris 0.75 M de chaque pH (7 /