Yaourt Denombrement Des Microorganismes Caracteristiques

de base déshydratés ou une préparation complète déshydratée.

Les prescriptions du fabricant doivent être suivies

scrupuleusement. Les réactifs chimiques doivent être de qualité analytique reconnue.

L'eau utilisée doit être de l'eau distillée dans le verre ou désionisée exempte de substances susceptibles d'influer sur la croissance des microorganismes

dans les conditions de l'essai.

Il convient de vérifier cet aspect périodiquement, particulièrement dans le cas de l'eau déminéralisée.

Il convient d'utiliser des solutions d'hydroxyde de sodium ou d'acide chlorhydrique (environ 0,l mol/l) afin d'ajuster le pH des diluants, sauf indication contraire.

3.2 DILUANT

Composition

Peptone1(hydrolysat tryptique de caséine…...….0,5 g

Peptone2(hydrolysat tryptique de viande……….0,5 g

Eau...................................................…...…….1000 ml

Préparation

dissoudre les peptones dans l'eau. Répartir la solution par ml dans des flacons de 150 ml de capacité.

stériliser à 121° C pendant 15 min.

Note :

les mélanges de peptones de ce type (peptone 1 et peptone 2 sont disponibles dans le commerce, par exemple les mélanges appelés « polypeptones ».

3.3 Milieux de culture

3.3.1 Milieu MRS acidifié

Composition

Peptone 1....................................................10 g

Extrait de viande..............................….......10 g

Extrait de levure déshydraté..............…...…5 g

Glucose (c6 H 12 06)…..........................…...20 g

Tween 80 (sorbitanne monoléate)........…..1 ml

Hydrogéno-orthophosphate dipotassique

(K2HPO4)......….......................................…2 g

Acétate de sodium, trihydraté

(CH3C02Na3H20)..................................……2 g

Cirate dammoniaque [C6H607 (NH4)2.)….…2 g

Sulfate de magnésium heptahydraté

(MnSO 47H20)..............................….........0,2 g

Suffate de manganèse tétrahydraté

(MnSO4.4H20)..............................….........0,05 g

Agar-agar.........................................…….9-18 g

Eau..................................................……1000 ml

Préparation

Dissoudre les composants dans l'eau en ébullition. Laisser

refroidir à 5° C et ajuster le pH à l'aide d'acide acétique (3.4.3) en contrôlant avec le pH-mètre (4.1.8) de sorte qu'après stérilisation il soit de 5,4 à 25° C.

Répartir le milieu par quantités de l00 ml dans des flacons de 150 ml ou par quantité de 200 ml dans des flacons de 250 ml.

Stériliser à 121° C pendant 15 min.

Note :

Des essais comparatifs ont montré que les Milieux MRS disponibles dans le commerce peuvent donner des dénombrements plus faibles que le milieu MRS préparé selon la présente méthode. Pour cette raison, si on les utilise, il faut les contrôler avec le milieu préparé d'après la présente méthode

Avant de commencer l'examen bactériologique, faire fondre complètement la quantité nécessaire de milieu dans un bain-marie en ébullition ou en vapeur fluente dans un récipient partiellement fermé. Refroidir le milieu fondu dans le bain-marie (4.1.7).

Pour contrôler la température de la gélose, il est recommandé de placer un thermomètre dans un même volume de solution de gélose à la même concentration que celle du milieu, contenue dans un récipient séparé, identique à celui utilisé pour le milieu. Cette solution servant au contrôle de la température doit être soumise aux même conditions de chauffage et de refroidissement que le milieu proprement dit.

3.3.2 Milieu M17

3.3.2.1 Milieu de base

Composition

Peptone1(hydrolysat trypsique decaséine).......2,50 g

Peptone2(hydrolysat pepsique de viande)........2,50 g

Peptone 3 (hydrolysat papaenique de soja)......5,00 g

Extrait de levure déshydratée..................…….2,50 g

Extrait de viande...........................……….......5,00 g

ß-glycérophosphate (sel disodique)

(C3H706PNa2)………………………….........19,00 g

Sulfate de magnésium heptahydraté

(MgSO47H20)............................……………..0,25 g

Acide ascorbique (C6H806)........…………….…50 g

Agar-agar ............................................……....9-18 g

Eau…………………………………………..950 ml

Préparation

Dissoudre les composants dans de l'eau en ébullition. Laisser refroidir à 50° C et ajuster le pH à l'aide des réactifs (3.4) en contrôlant avec le pH-mètre (4.1.8), de sorte qu'après stérilisation, il soit de 7,1 à 7,2 à 25° C. Répartir le milieu par quantités de 95 ml dans des flacons de 150 ml. Stériliser à 121° C pendant 15 min.

Note :

Des milieux complets Ml7 sont disponibles dans le commerce, mais comme c'est le cas pour les milieux MRS du commerce, les résultats obtenus peuvent différer de manière significative d'un fournisseur à l'autre- Pour cette raison, il convient de les contrôler avec le milieu Ml7préparé d'après la méthode

3.3.2.2 Solution de lactose

Composition

Lactose (C12H22O11)...............…10 g

Eau.........................................100 ml

Préparation

Dissoudre le lactose dans l'eau; stériliser à 121°C pendant

15 min.

3.3.2.3 Milieu complet

Composition

Milieu de base (3.3.2.1)..............….95 ml

Solution de lactose (3.3.2.2)..........…5 mI

Préparation

Immédiatement avant emploi, faire fondre le milieu de base (3.3.2.1) dans un bain-marie en ébullition et laisser refroidir à 48-50° C. Chauffer la solution de lactose (3.3.2.2) à 48-50° C.

Ajouter la solution de lactose au milieu de base et mélanger soigneusement par des mouvements rotatifs. Refroidir le milieu dans le bain-marie (4.1.7).

3.4 Réactifs pour ajuster le pH

3.4.1 Hydroxyde de sodium (NaOH), solution environ

0,l mol/1.

3.4.2 Acide chlorhydrique (HCI), solution environ

0,l mol/1.

3.4.3 Acide acétique (CH 3COOH), 100% (glacial).

4 APPAREILLAGE & VERRERIE

4.1 Outre le matériel de laboratoire microbiologique courant, matériel requis pour la préparation des échantillons et des dilutions.

4.1.1 Incubateur 37 ±1° C.

4.1.2 Incubateur anaérobie, pouvant être réglé à37 ± 1° C, ou récipients de culture anaérobie, fournissant une atmosphère de 90% d'azote et 10% de dioxyde de carbone.

4.1.3 Mélangeur, soit de type péristaltique avec récipients stériles en plastique, soit de type rotatif, pouvant fonctionner à une vitesse minimale de rotation de 20000 min avec récipients en verre ou en métal de capacité appropriée.

4.1.4 Agitateur de tubes à essais (par exemple, agitateur vortex).

4.1.5 Matériel de comptage de colonies, comportant un système d'éclairage avec fond noir, muni d'une loupe grossissant 1,5 fois et d'un compteur