TP Purification du lysozyme

TP PURIFICATION DU LYSOZYME                

BUT

Le but de ce TP est de purifier le lysozyme à partir d’un blanc d’œuf en effectuant sa purification par la chromatographie d’échange d’ions. Puis, dans un second temps, de mesurer l’activité enzymatique du lysozyme à l’aide du dosage spectrophotométrique ce qui nous permet de déterminer le niveau de pureté de l’enzyme. Et enfin, de réaliser le dosage des protéines par la méthode colorimétrique de Bradford pour déterminer la concentration du lysozyme présent dans le blanc d’œuf.  

PRINCIPE

Les principales méthodes utilisées lors de ce TP sont :

1. IEX (Ion Exchange Chromatography) ;
2. La spectrophotométrie ;
3. La méthode colorimétrique de BRADFORD.

La structure du lysozyme et les propriétés acido-basiques des acides aminés

Le lysozyme (mucopolypeptide-N acétyl-muramylhydrolase) est une enzyme ayant la nature protéique qui est composé de 129 acides aminés, et comprend 4 ponts disulfures lui conférant une bonne résistance à la dénaturation thermique.

Un acide aminé possède au moins 2 fonctions ionisables : un groupement carboxyle –COOH et un groupe amine –NH2.

En milieu basique, le groupement carboxyle –COOH se comporte comme pun acide faible et libère un proton H+.

En milieu basique, le groupement amine –NH2 se comporte comme une base faible et cède un proton H+.

Ces propriétés acido-basiques permettent de déterminer différentes formes de l’acide aminé en fonction du pH (forme anionique ou cationique). Si l’acide aminé possède un groupement ionisable sur sa chaine latérale de plus, on obtient une forme supplémentaire.  A chaque pH un acide aminé a une forme prédominante.

Lorsque l’acide aminé est électriquement neutre c’est-à-dire qu’il n’a pas de charge, on dit qu’il est sous forme zwitterionique et le pH correspondant à cette forme est appelé pH isoélectrique et noté pHi.

Chromatographie d’échangeur d’ions IEX

 IEX=  Ion Exchange Chromatography

La séparation par la chromatographie d’échangeur d’ions se réalise en se basant sur la différence de leur charges de surface nettes (net surface charge). Les groupements chargés varient d’une molécule à l’autre ce qui donne les valeurs de pKa différentes en fonction d’une structure moléculaire.

IEX tire parti du fait que la relation entre la charge de surface nette et le pH est unique pour une protéine spécifique.

Dans une séparation IEX, les ions sont liés par des interactions électrostatiques (liaisons ioniques) d’un support insoluble et chimiquement inerte d’une manière réversible par des ions en solution. Les interactions réversibles entre les molécules et la résine IEX de charge opposée sont contrôlés afin de favoriser la liaison ou l'élution de molécules spécifiques et réaliser la séparation.

• Une protéine qui n'a pas de charge nette (donc, qui est sous sa forme zwitterionique,) à pH=pI (point isoélectrique), n'interagira pas avec la résine;
• A un pH>pl (protéine chargée négativement), une molécule se lie à la résine échangeuse d’anions (chargée positivement);
• A un pH<pI (protéine chargée positivement), une molécule se lie à la résine échangeuse de cations (chargée négativement).

En plus des interactions d'échange ionique, il y aura d’autres liaisons produites par des forces de Van der Waals et des interactions non polaires ayant une faible intensité.

Elle s’ effectue en 5 étapes:

1.Équilibration: la colonne est équilibrée ;

2.Charge : les protéines portent en surface des résidus d’acides aminés chargés et peuvent donc s’adsorber sur les groupes échangeurs des résines ; les protéines à charge négative nette sur les échangeurs d’anions et les protéines à la charge positive nette sur les échangeurs de cations.

3.Lavage : la force d’adsorption augmente avec la charge nette. Il faut donc prendre en compte les conditions d’adsorption des protéines ( pH faiblement acide ou basique et faible concentration en sels)

4.Élution: il existe deux façons d’éluer les protéines fixées sur l’échangeur. On peut réduire la charge nette en modifiant le pH ou ajouter le sel (contre-ion) de même charge que la molécule fixée en concentration pour bloquer les charges de l’échangeur d’ions. Lors de ce TP nous avons changé le pH.

5. Régénération : la résine est régénérée .

Lors de ce TP on a fait une CEX  ( Cation Exchange Chromatography) effectuée sur la résine CM-cellulose (carboxyméthyl cellulose) (phase stationnaire).[pic 1]

CM-cellulose est un support faiblement acide avec le groupement fonctionnel ionisable –CH2COOH. Il est souvent utilisé pour séparer les protéines basiques des neutres.

Nous avons choisi ce type de la résine en force des propriétés des principales protéines contenues dans le blanc d’œuf. Leurs caractéristiques sont présentées dans le tableau suivant :

A partir du tableau on peut voir que l’enzyme dont nous nous sommes intéressées est minoritaire avec le taux de 3% et qu’elle possède un pHi le plus élevé (11). Les trois autres, ovalbumine (65%, pHi=4.6), conalbumine (14%, pHi=6.8) et ovomucoide (9%, pHi=4), ont les pHi beacoup moins faibles.

Pour cela nous avons utilisé un tampon (phase mobile) avec le pH assez élevé pour que les protéines soient chargées négativement (et n’interagissent pas avec la résine qui est chargée négativement) donc éluées en premières, et le lysozyme reste fixé sur la résine par des liaisons ioniques.

Le tampon d’équilibration réalisé contient NaCl 0,05 M, Tris-HCl 0,05 M et de l’H2O. Son pH est égal à 8,2, ce qui permet de charger négativement les 3 premières protéines et ne pas influencer la basicité du lysozyme.

Dosage spectrophotométrique

A l’aide d’un spectrophotomètre et à une longueur d’onde donnée, il est possible de mesurer l’absorbance d’une solution. Plus l’échantillon est concentré, plus il absorbe la lumière dans les limites de proportionnalité énoncées par la loi de Beer-Lambert :

A= ɛ* l * C

Аvec:

1. A = l’absorbance de la solution
2. ɛ = coefficient d’absorption molaire (en M-1.cm-1)
3. l = longueur de la cuve (cm)
4. c = concentration du soluté (en mol/L)

Grace à ce dosage il est possible de mesurer l’activité enzymatique du lysozyme.

Gamme étalon

Puisque l'absorbance est proportionnelle à la concentration des protéines contenues dans les fractions, on établit une gamme étalon de tubes contenant le composé à doser à des concentrations connues. La droite ainsi obtenue [A = f (quantité́ de produit par prise d'essai)] sera ensuite utilisée pour trouver la concentration d'une solution inconnue à partir de son absorbance.

La méthode colorimétrique de Bradford

Réactif composé de Brillant Blue Coomassie de couleur marron réagit par des interactions hydrophobes et électrostatiques avec acides aminés des protéines, en modifiant les propriétés spectroscopiques du réactif, qui devient alors bleu, le maximum d'absorbance passe à 595 nm. L'intensité de la coloration, donc l'absorbance est proportionnelle à la quantité de protéines dans l'échantillon dosé.

Mesure de l’activité enzymatique :

Le lysozyme est une enzyme hydrolysant les liaisons β-1,4 entre l’acide N-acétylmuraminique et les résidus 2-acétamido-2-désoxy-D-glucose des muco-polysaccharides des parois bactériennes. L’activité enzymatique est déterminée grâce à la propriété du lysozyme d’hydrolyser les parois des cellules bactériennes, et est mesurée à l’aide d’un spectrophotomètre à 450 nm.