CR TP

                                                       Académie Aix Marseille

Compte rendu de TP : Membrane interne de la mitochondrie et réactions

1. Introduction :

Nous avons participé TP consistent à fractionner les mitochondries et mettre en évidence le rôle des chaînes d’oxydoréduction au niveau des complexes protéiques et inversement.

Nous nous sommes penché sur la mitochondrie, qui est un organite de nos cellules et qui participe à la chaine respiratoire (pour la création d’ATP), elle a son propre ADN et est composée de deux membranes (interne et externe) a ports pour les échanges protéique et chimique.

Nous allons nous pencher sur la chaîne respiratoire : il y a tout d’abord la glycolyse, qui consiste à casser un glucose en deux pyruvates et qui se passe dans le milieu cytoplasmique de la cellule ; qui peut ensuite passer par les ports de la mitochondrie avec de l’ATP et du NADH.

Puis vient le cycle de Krebs, des réactions suivant un ordre cyclique qui a terme, produit de l’ATP, du NADH, FADH et un succinate.

La dernière étape se passe dans la chaine respiratoire mitochondriale, où des oxydoréductions fournies de l’énergie pour les composés qui se déplacent de complexe en complexe libèrent des protons, qui s’accumulent en gradient de proton, puis passent pas le port de l’ATP synthase ce qui fabrique de l’ATP. (Voir figure 1)

La chaîne respiratoire permet à terme la production de 32 molécules d’ATP

1. Méthodes :

1 - La séparation des mitochondries de leurs milieux cellulaires :

Nous avons commencé à broyer de la pomme avec un tampon de broyage (qui permet, par choc osmotique en milieu hypotonique, de créer un phénomène de turgescence) pour lyser les membranes des cellules de la pomme avec un mixer.

Puis on centrifuge pour précipiter les éléments les plus lourds (comme les membranes ou les noyaux) et de garder les éléments plus légers (dont les mitochondries) pour les mettre dans un autre tube.

On centrifuge de nouveau jusqu’à faire précipiter les mitochondries que l’on fera suspendre puis on éclatera les mitochondrie grâce a un poter et à l’action mécanique dont il se sert.

Nous avons donc ouvert les mitochondrie et l’ajout d’un succinate devrait en théorie réagir directement avec les complexes 2 et 3.

Nous avons dû faire attention aux règles de sécurités car un des échantillons contenait un produit dangereux = le cyanure

2 – Mise en évidence de l’action enzymatique de la mitochondrie avec spectrophotomètre :

Pour la spectrophotométrie (dont nous allons règles l’absorbance a 550nm), nous avons préparé trois échantillons :

        -Le premier contient une fraction mitochondriale, du cytochrome oxydé et du tampon phosphate, il sert de tare.

        -Le deuxième contient les mêmes composées en plus du succincte et du cyanure (le cyanure qui sert à inhiber les réactions d’oxydoréduction au niveau du complexe 4).

        -Le troisième contient les mêmes éléments que le deuxième mais sans cyanure (donc on s’attends à ce que les réactions se passent normalement jusqu’à épuisement du substrat).