Extraction de Polyphénols à partir des Grenades par un fluide supercritique CO2

1. Grenade et polyphénols

La grenade est recouverte d’une écorce épaisse, à l'intérieur de laquelle sont contenus les arilles, qui constituent la partie comestible du fruit. Chacun est composé d’un pépin entouré de pulpe translucide contenu par une très fine membrane [2].

Ce fruit est riche en composés bioactifs, y compris les acides phénoliques, présentant ainsi une activité anti-oxydante. Il est majoritairement composé d’ellagitannins, notamment la punicalagine et la punicaline, mais il contient également des tannins hydrolysables tels que les acides ellagique et gallagique, des anthocyanines, des flavan-3-ols et flavonoïdes (catéchine, épicatéchine, lutéoline, kaempférol, quercétine, rutine), des acides hydroxycinnamiques (acide caféique, chlorogénique, p-coumarique) et des pro-anthocyanidines, responsables de la couleur rouge des grenades. L’écorce est la fraction la plus riche en polyphénols [2].

2. Méthode d’extraction des polyphénols

Il existe de nombreuses méthodes pour extraire les polyphénols. Les techniques conventionnelles utilisent des solvants organiques ou l’eau et sont réalisées à pression atmosphérique. En général, les solvants utilisés sont « non alimentaires » de type acétone, méthanol, acétate d’éthyle ou éventuellement l’éthanol (alimentaire).

En raison des réglementations environnementales plus strictes, l’extraction par fluides supercritique (EFS) a connu une forte croissance ces dernières années en tant qu’alternative aux procédés conventionnels d’extraction. Le dioxyde de carbone CO2 est le fluide supercritique le plus utilisé en raison de ses coordonnées critiques facilement accessibles (Tc=31°C et Pc=7,3 MPa), de sa faible toxicité et réactivité, de son ininflammabilité, de sa disponibilité y compris de sa haute pureté et de son faible coût. Ses propriétés de transport (viscosité, diffusivité) permettent une pénétration plus profonde dans la matrice solide et donc une extraction efficace et rapide des composés apolaires.

Cependant, le CO2 supercritique n’est pas adapté à l’extraction de molécules polaires, comme les polyphénols. Pour palier cette faible capacité de solubilisation, il est additionné d’un cosolvant, qui sera choisi en fonction des interactions avec les molécules à extraire. Pour des applications agro-alimentaires, l’éthanol est le cosolvant de choix. Mushtaq et al. ont extrait des composés phénoliques antioxydants de peau de grenade par (CO2+ éthanol) supercritique assisté par enzymes [3].

3. Méthodes de caractérisation des composés phénoliques

Après extraction du matériel végétal, les composés phénoliques peuvent être dosés soit dans leur totalité, soit individuellement. La méthode la plus utilisée pour le dosage des composés phénoliques totaux est celle de Folin-Ciocalteu. La teneur en polyphénols totaux est quantifiée par dosage colorimétrique et exprimée en équivalent acide gallique, ou acide ellagique pour la grenade.

La méthode la plus largement utilisée pour séparer les composés phénoliques, et pour les doser individuellement, est la séparation par HPLC en phase inverse (l’octadécylsilice ou C18). Les gradients d’élution comportent des proportions croissantes de solvant organique (méthanol ou d’acétonitrile) dans de l’eau acidifiée. Les composés sont élués par ordre de polarité décroissante et leur détection est basée sur leur absorption caractéristique dans l’UV-Visible. Pour l’identification, ce système est couplé à la spectrométrie de masse. Par exemple, cette technique a ainsi permis d’identifier 151 composés phénoliques et 65 dérivés d’anthocyanine de la grenade [4]

Démarche expérimentale

1. Détermination des profils HPLC

Les analyses sont réalisées sur une chaine HPLC Agilent Infinity n° équipée d’un dégazeur, d’une pompe quaternaire, d’un injecteur automatique et d’un détecteur à barrette de diodes. Les composés phénoliques sont séparés sur une colonne Spherisorb ODS2 C18 (250 x 4,6 mm 5μm) par gradient d’élution (Poyrazoglu et al. [5] modifiée). Les solvants (A) et (B) correspondent respectivement aux solutions eau/acide formique 95/5 (v/v) et méthanol (qualité HPLC). Les extraits sont filtrés à 0,2 μm avant injection (50 μL). L’élution se fait à 25°C à un débit de 1 ml/mn suivant le gradient : 10 à 30% B en 20 mn ; 30 à 50% B en 15 mn ; 50 à 90% B en 5 mn ; 90 à 10% B en 4 mn et stabilisation à 10% B pendant 16 mn. Le chromatogramme a été enregistré à 280, 320, 360 et 520 nm avec une bande passante de 2 nm, avec des spectres d’absorption enregistrés en continu.

2. Identification et quantification des composés phénoliques

Les constituants des extraits de grenade ont été identifiés grâce à 15 solutions standard,

caractérisées par leurs temps de retentions et leurs spectres d’absorption [Annexe]. Plusieurs solutions de concentrations différentes ont été injectées à des volumes différents (2-20 μL) afin d’obtenir les droites de calibration (Aire de pic en fonction de la masse injectée en μg). 10 à 20 injections ont été réalisées par standard.

Le pic de chaque molécule est intégré. On obtient le temps de rétention (tr) et l’aire du pic. Il existe deux façons de quantifier les polyphénols à partir des chromatogrammes :

- pour les pics identifiés, c’est à dire correspondants à un standard (1, 2 et 3 sur la figure 2), on peut quantifier les polyphénols à partir des droites d’étalonnage correspondantes

- de manière globale, en tenant compte de l’aire totale du chromatogramme et en raisonnant en équivalent d’un polyphénol de choix (ici l’acide ellagique, polyphénol majeur de la grenade) pour quantifier l’ensemble des polyphénols présents.

3. Extraction classique et profil de référence

Les extractions sont réalisées sur des coproduits de la grenade, à savoir les parties résiduelles après extraction du jus : l’écorce E et le pépin pulpe pressée appelé par la suite pépin P.

Afin de comparer les méthodes d’extraction, un profil HPLC de référence est indispensable. L’extraction de « référence » correspond à l’extraction totale de tous les polyphénols de la matière. Pour cela, 1g de poudre de matière est extrait de manière successive, 3 fois, par 5mL d’un mélange méthanol : eau : acide acétique (70 :28 :2 ; v :v :v ) sous ultrasons 30 mn, suivie d’une centrifugation à 4600g, 10 mn.

Résultats et Discussions

1. Standards

Des étalons de polyphénols correspondant à ceux rencontrés dans la grenade [2][5] sont analysés. Les temps de rétention, constantes de réponse K (Aire = K x quantité injectée μg) et longueurs d’onde λmax de maxima d’absorbance des 15 étalons sont reportés dans le tableau 1 ainsi que les gammes de concentration des solutions utilisées et la longueur d’onde de mesure λdétection.

Polyphénols Tr (mn) K C (g/L) λ détection(nm) λmax (nm)

Acide Gallique 4,3 1543,5 0,02-0,08 280 276

Punicalagin 5,1-7,2 2779,1 0,11-2,23 280 260-380

Acide Protocatéchique 7,38 960,71 0,73-3,64 280 262-296

Catéchine 10,3 390,47 19,724 280 242-280

Théobromine 11,65 1685,2 0,03-0,13 280 276

Théophylline 14,26 - 0,03-0,15 280 274

Acide Chlorogénique 14,6 - 8,05 280 246-300-328

Acide Caféique 15 1482,8 0,01-0,05 280 246-300-328

Épicatéchin 16,75 - 19,92 280 242-280

Caféine 22,8 1765,3 0,13 280 274

Acide Férulique 24,8 1616,2 0,10-0,51 280 246-300-322

Acide Sinapique 26,4 3013,9 0,02-0,1 320 242-326

Rutin 32,1 868,91 0,01-0,08 360 258-358

Acide Ellagique 34,3 1529,9 0,01-0,08 280 256-368

Quercétine 39,57 1963,5 0,01-0,08 360 258-372

Les composés sont bien séparés et les courbes d’étalonnage sont très satisfaisantes (R2 > 0,99). La méthode de séparation sera donc efficace pour séparer les polyphénols des extraits de grenade. Cependant, les chromatogrammes obtenus pour certains composés (punicalagine, acide ellagique) injectés en trop grande quantité sont déformés (présence d’un pic à 2,8 mn  molécules non retenues), bien que l’aire totale soit toujours proportionnelle à la quantité injectée.

2. Chromatogrammes des extraits

Les extraits à analyser ont été obtenus avant mon stage à partir d’écorce et/ou pépin, par macération à l’éthanol ou extraction sous pression par CO2 supercritique avec différent pourcentage en éthanol. Pour chaque extraction, 3 à 5 extraits sont récoltés