Propriétés physicochimiques des acides nucléiques

Propriétés physicochimiques des acides nucléiques:

Stabilité dépend de la présence:

-des liaisons H (stabilisent),

-de plans de noyaux insaturés superposés(bases aromatiques)=force de van der Waals (stabilise),

-de phosphates donc charges négatives(déstabilise)=(interactions ioniques avec les cations stabilisent)

Types d’ADN et sillons:

Intéractions protéine/ADN dépend du sillon

-ADN B le grand en haut quand les C5’ sont en haut (11,7A, et le petit 5,7A)

-ADN A petit sillon est inaccessible (trop petit 2,7A), présent dans l’ADN déshydraté ou fixé par ADN polymérase, possible d’être une structure de prédilection dans les hybrides ARN-ADN ou ARN db par ex dans les ARNt structures tige-boucle des séquences palindromiques

-ADN Z sillons de même taille, riche en GC et une petite partie présent proche des promoteurs pour stimuler la transcription ( ADN B et ADN Z se lient en une structure cristalline?)

Structures triple hélice existe T+AT ou C+GC

Mobilité électrophorétique de l’ADN:

Eléctrophorèse en gel d’agarose par migration des molécules sous l’action d’un champ électrique. Les acides nucléiques sont négativement chargés à cause du phosphate donc migrent vers le pôle +. Petites molécules migrent plus rapidement que les grandes. Il se lit dans le sens 5’->3’ donc de plus léger vers plus lourd= pôle + vers le pôle -.

ATTENTION molécules de même masse peut avoir des mobilités diff dépendant de leur structure 3D

Un smear; bandes trop proches

Chromatographie:

Séparation des prot par rapport à leur taille (ou charge etc). Par ex 20 tubes de 200 microlitres les grosses molécules arrivent en premier.

Absorbance DO et hyperchromicité:

Dans spectrophotométrie les AN absorbe le mieux à 260 nm c le mesure de DO

- absorbance dans L'UV augmente lorsqu’ils subissent une dénaturation= cassure des liaisons H (c réversible), SB absorbe plus que DB

1)T élevée favorise la dénaturation

Liaisons H stabilisent la molécule donc si nombre de liaison H augmente Température de dénaturation augmente, alors brin riche en AT se dénature plus facilement que celui riche en GC

(Tm1/2: T où on a 50% db 50% sb)

2)La force ionique élevée favorise la renaturation

Par ex; Solution NaCl défavorise la dénaturation

Les ions Na+ stabilisent les charges - de l'ADN (phosphates) donc diminue la poussée entre les de brins. Vu que les brin sont plus stables, T° de dénaturation augmente

3)Concentration élevée favorise la renaturation

Paramètre cinétique: c0*t (en mole x sec/L)

Concentration élevée = probabilité de rencontre des brins complémentaires élevée

Si concentrations sont égales: le génome le plus court réhybride le plus vite (plus grand nombre de copies au lieu des génomes énormes renaturent plus rapidement)

Les morceaux plus répétés se renaturent plus vites

4) Complémentarité des brins très imp, les brins qui sont pas 100%complémentaires peuvent se lier mais c pas très stable. Les brins mutés se dénaturent plus facilement que ceux sauvages! Même avec les mutations double brin se forme mais peut former des boucles exclus ou mismatch des qlq bases etc

Identification d’une mutation: maladies génétiques causées par ex une fausse paire de base AA au lieu de AT;

incubation avec sonde complémentaire radioactive permet de créer un double brin locale de petite taille marqué

Les AN mutés sont déjà pas très stables alors ils va se dénaturer un peu plus tôt que ceux venant des sujet sains et on identifie l’individu porteur de la mutation (lavages)

Pour les ARN: la structure n’est jamais simplement sb, il existe des parties db = tige-boucle. L'absorbance augmente peu à peu au cours du temps car les structures tiges sont lâchées.

PCR: Polymerase Chain Reaction:

Pour avoir plus de matière à analyser ou pour se rendre compte de la présence d’un AN

1)chauffage à 95 °C pour dénaturer l’ADN

2) ajout d’amorces + refroidissement à 50°C (sans amorce ADN pol peut pas commencer une polymérisation spécifique)

Premier cycle= 1->2 double ok mais par ex 3e cycle= 4->16 alors c 2^x (x étant n de cycle-1)

20 cycles à partir du premier cycle= 2^20 molécules

Qlq définitions:

-Hélicase (ADN B): qui sépare les 2 brins de la double hélice, se fixe sur le brin retardé, consomme grande qté d’ATP

-Topoisomerase (DNA gyrase): coupe soit sb soit db pour dérouler l’ADN superenroulé

-Primase: produit les amorces pour que pol reconnaisse l’extrémité 3’

-Nucléase: enzyme qui dégrade les AN

—Exonucléase: attaque que les extrémités

—Endonucléase: attaque partout -> enzymes de restriction

——Enzymes de restriction: attaquent les sites de restriction et les coupent

———Site de restriction: séquences palindromiques où le brin matrice et complémentaire ont dans un même ordre les m 6 nt : 3’GAATTC5’ et 5’CTTAAG3’

-Télomérase: ADN pol ARN dépendante qui crée des télomères

—Télomères: séquences répétitives pour empêcher la scénéscence

-Ligase: soude les fragments

-Les protéines SSB: single strand binding protéines qui se fixent au simple brin pour l’empêcher de réunir avec l’autre brin

-Southern Blot: ADN

-Northern Blot: ARN

-Western Blot: prot

Replication

Precurseurs: desoxyribonucléosides triphosphates

La réplication du génome doit se faire:

- Complètement: tout le matériel chromosomique doit être transmis

- Fidèlement: aucune erreur ne doit être faite (risque de mutation)

- Précisément: lors de chaque division cellulaire

ADNi+dNTP->ADNi+1+PP

Il existe 3 modes de replication

C le mode semi-conservative utilisé pour l’ADN, expérience Meselson et Stahl (centrifugation: ADN léger migre moins)

Mécanisme moléculaire de la réplication:

Fourche de réplication: forme thêta dans les 2 sens sur adn circulaire

ADN pol polymérise dans le sens 5’-> 3’ avec l’aide d’une extrémité 3’ qui est l’amorce fait par primase sur le brin matrice

Les dNTP qui ont 3 phosphates sont intégrés par les ADN pol, ils vont perdre la liaison entre les phosphates alpha et beta par condensation pour créer la liaison phoshodiester

Radiomarquage: structures AZT et 3TC ont pas le OH au C 3’ alors ne font pas de liaison phosphodiester: polymérisation s’arrête.

ddNTP : 2’-3’-didéoxynucléotides triphosphate alors pas de liaison phosphodiester: ils arrêtent la polymérisation et on obtient des morceaux d’ADN de différente taille chaque fois un ddNTP au lieu de dNTP est utilisé (par ex ddTTP marqué)

C comment on séquence l’ADN, one by one

Réplication de l’ADN chez les procaryotes:

Les ADN polymérases procaryotes sont de 3 types (I, II et III) et

les ADN polymérases eucaryotes de 5 types (α, β, δ, ε et γ).

ADN pol I: pol 5’->3’, exo 5’->3’ et exo 3’->5’ amorces

ADN pol II:pol 5’->3’ et exo 3’->5’ réparation

ADN pol III: 3 sous unités: principale

Alpha pol 5’->3’

Beta exo 3’->5’