Protocole de l'induction de protéines

Culots bactériens

1. Transformation par choc thermique

1. Placer les tubes eppendorf dans la glace
2. Déposer 40µl de la suspension de cellules compétentes dans chacun des tubes
3. Ajouter 2µl du mélange de ligation (plasmide + insert)
4. Laisser 30 minutes environ dans la glace

Choc thermique (ADN pénètre dans la cellule)

1. Bain thermostaté à 42°C
2. Après les 30 minutes dans la glace plonger les tubes dans le bain à 42°C pendant 90 secondes EXACTEMENT
3. Refroidir les tubes dans la glace 1 à 2 minutes
4. Ajouter 2ml LB préchauffé à 37°C
5. Incuber 1 heure à 37°C + agitation pour exprimer la résistance- plasmidique
6. Centrifuger 3minutes à 4000rpm, jeter le surnageant environ 800-900µl
7. Reprendre le culot dans 200 µl de milieu restant
8. Étaler 200µl sur boîte LB + antibiotique
9. Incuber 37°C O/N

2. précultures[pic 1][pic 2][pic 3][pic 4][pic 5][pic 6][pic 7][pic 8]

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Incuber O/N  37°C sous agitation

1. Cultures et induction à l’IPTG

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• Incuber les cultures à 37°C sous agitation jusqu’à atteindre DO600 entre 0,4 et 0,8.

Si DO ok :

• Garder un aliquot de chaque culture avant et après induction à -20°C pour dépôt sur SDS-page 12%
• Induire les cultures avec 1mM soit 96mg d’IPTG pour 400ml de culture puis incuber à 37°C pendant 3h sous agitation.

1. Culots

Régler la centri à 4°C et la fermer

• Garder un aliquot de chaque culture après induction à -20°C pour dépôt sur SDS-page 12%
• Les cultures sont centrifugées pendant 15min à 5000rpm à 4°C
• Les culots bactériens sont poolés et repris dans du Bining Buffer 1X à raison de 4ml /200ml de culture dans des pots ECBU
• Stockage à -80°C