Protocole extraction lipides

Protocoles utilisés par le laboratoire PBA

PREPARATION des ECHANTILLONs pour assurer l’extraction des lipides

1. Prélèvement du volume nécessaire (base de 300 millions de cellules)
2. Filtration sur filtre GF/F préalablement étuvé à 450°C pour certaines espèces
3. OU Centrifugation pendant 10 minutes à 4000tr/min à 5°C

1. Elimination du surnageant. Mettre en suspension le culot dans 2 ml d’une solution de NaCl 35‰ puis transvaser le tout dans des tubes en verre. Centrifuger 20 minutes à 1200 tr/min à 5°C. Répéter cette étape deux fois.

1. Ajouter 6 ml de réactif de Folch (mélange méthanol-chloroforme 1/2) pour chacun des cas puis mettre au congélateur à –80°C pour éviter toute dégradation enzymatique.

Analyse des lipides totaux

Décongeler les échantillons le jour de l’analyse.

Sonication (de préférence en mode pulse) durant 10 min dans un bain de glace pilée.

NB : Si parfois il reste de l’eau, transvaser les échantillons dans des tubes coniques, ajouter du chloroforme et laisser décanter. Récupérer la phase inférieure et la conserver dans les tubes 8 mL. Répéter cette étape tant qu’il y aura de l’eau.

• Prélever 3 mL d’extrait conservé dans le réactif de Folch
• Ajouter 3 mL du mélange CHCl3 / MeOH 1:2
• Ajouter 2.7 mL d’eau distillée
• Agiter vigoureusement pendant 5 min puis centrifuger à 1500 tours/minutes pendant 10 minutes.
• Récupérer les phase chloroformique (inférieure) dans un tube à hémolyse préalablement pesé sur une balance de précision

• Ajouter 3 mL de chloroforme à la phase aqueuse restante
• Agiter vigoureusement pendant 2 min et centrifuger à 1500 tours/minutes pendant 10 minutes.
• Ajouter la phase chloroformique (inférieure) dans le tube à hémolyse contenant déjà la phase organique précédente.

• Ajouter 3 mL de chloroforme à la phase aqueuse restante
• Agiter vigoureusement pendant 2 min et centrifuger à 1500 tours/minutes pendant 10 minutes.
• Ajouter la phase chloroformique (inférieure) dans le tube à hémolyse contenant déjà les 2 phases organique précédentes.

• Evaporer sous azote
• Peser les tubes sur une balance de précision
• Conserver les tubes sur un portoir dans un dessicateur et renouveler la pesée 24h00 plus tard.

Séparer les trois classes ( lipides neutres, glycolipides et phospholipides) d’un extrait, et pouvoir ainsi estimer leur quantité et qualité.

1 / Préparation de la silice

• Peser une petit ballon a col rodé
• Introduire de la silice à l’intérieur
• Fermer le ballon à l’aide d’un papier d’aluminium
• Mettre le tout à brûler durant 4h00 à 450°C
• A la sortie du four, peser le ballon rempli de silice
• Réhydrater la silice à 6% en y introduisant de l’eau distillée
• Mettre le ballon à tourner sur un rotavapor durant 24h00.

2 / Séparation

• Placer de la laine de verre sylanisée dans le fond de la pipette pasteur de manière à en obstruer l’extrémité (sur environ 2 mm). Tasser légèrement
• Fixer l’entonnoir sur la pipette pasteur
• Introduire de la silice 60 réhydratée dans la pipette pasteur de manière a former une colonne de 4.5 cm avant de tasser et 4 cm après avoir tassé la silice.
• Fixer la colonne sur le support et faire passer environ 5 mL de chloroforme (de manière à observer un débit régulier).

• Peser un petit tube à hémolyse préalablement brulé (ceci pour supprimer tout dépôt éventuel de matière organique)
• Introduire 3 mL de l’échantillon à séparer, puis évaporer à sec sous azote.
• Peser le tube contenant l’échantillon (= Quantité d’extrait déposé)
• Reprendre l’extrait avec 200µL de chloroforme/méthanol (Folch), vortexer
• Déposer délicatement l’échantillon le long de la paroi de l’entonnoir (pour ne pas perturber la surface de la colonne de silice)
• Faire pénétrer l’échantillon dans la colonne
• Faire passer successivement les volumes de solvant suivant :

• Lipides neutres = 10 mL de chloroforme
• Glycolipides = 20 mL d’acétone
• Phospholipides = 15 mL de méthanol

• Evaporer l’ensemble des fractions sous azote, de manière à ce qu’il reste environ 1 mL dans les tubes.
• Transvaser chacune des fractions dans des tubes à hémolyse, préalablement brulés, puis pesés
• Evaporer à sec chacune des fractions
• Peser les petits tubes.
• Reprendre chacune des fractions à l’aide de 3 * 500µL de chloroforme/méthanol (2:1 v/v), dans des petits tubes de 7 mL
• Conserver l’ensemble des fractions au congélateur à –20°C, avant de les méthyler

Matériel

• Pipettes pasteur (VWR réf = 612-1701)
• Entonnoirs verre (diamètre 5 cm)
• Porte pipettes
• Laine de verre silanysée (Batallier réf = 58321)
• Tubes en verre 25 mL (Interchim réf = 181880)
• Tubes en verre 7 mL (Interchim réf = 181860)
• Tubes à hémolyse

Solution et réactifs

• Silice 60 (Merck 0.063-0.200 réf = 1.07734)
• Chloroforme (Merck suprasolv  réf = 1.02432)
• Acétone (Carlo erba  réf = 508201)
• Méthanol (Carlo erba  réf = 525101)

Durée de la manipulation : environ 3h00 pour séparer 3 à 4 échantillons

TRANS-ESTERIFICATION ou Méthylation pour obtenir les acides gras totaux des lipides totaux ou des différentes classes

(1) Solution étalon interne 2.3µg/mL: diluer 10 fois la solution concentrée (100µL dans 2.3mL)

(2) Ajouter 10µL de solution d ‘étalon interne C23 ou C17 dans les 2ml de chaque échantillon