TP Introduction à la microbiologie

Compte Rendu de Travail Pratique d’HLBI201 n°1 :

TP1,2 ET 3

INTRODUCTION:

Par définition, la microbiologie est l'étude de tous les organismes vivants trop petits pour être visibles à l'œil nu. Cela comprend les bactéries, les archées, les virus, les champignons, les prions, les protozoaires et les algues (microalgues), collectivement appelés microbes. Ces microbes jouent un rôle clé dans le cyclage des éléments nutritifs, la biodégradation, les changements climatiques, le gâchis alimentaire, la cause et le contrôle des maladies et la biotechnologie. Grâce à leur polyvalence, les microbes peuvent être mis en œuvre de plusieurs façons: fabriquer des médicaments qui sauvent des vies, fabriquer des biocarburants, nettoyer la pollution et produire et transformer des aliments et des boissons.

-----}OBJECTIFS: 

Les examens microscopiques:Coloration de Gram et état frais

 * Savoir réaliser une préparation microscopique colorée par la technique de Gram

 * Savoir différencier des bactéries à Gram positif des bactéries à Gram négatif

 * Déterminer le principe de la coloration de Gram

 * Savoir réaliser une suspension bactérienne

 * Savoir réaliser un état frais et comprendre son interprétation

Les examens macroscopiques des cultures bactériennes:

* Savoir décrire les caractères macroscopiques sur gélose inclinée solide

* Savoir décrire une colonie isolée sur gélose nutritive en boîte de Pétri

* Savoir mettre en relation des résultats de l'observation macroscopique des colonies avec les examens microscopiques réalisés sur cette souche.

Test du type respiratoire pour la bactérie Gram+ :

*Déterminer le type respiratoire d’une bactérie, c’est-à-dire définir son comportement vis-à-vis du dioxygène.

Test antibiogramme sur la bactérie Gram- :

*Bonnes pratiques en antibiothérapie

*Interpréter un antibiogramme

*Comprendre les mécanismes de résistance et leurs impacts sur le spectre d’activité des antibiotiques

DISCUSSION ET ÉTUDE DES RÉSULTATS:  

A- ETUDE D’UN MÉLANGE POLYMICROBIEN:

1. Observation état frais, coloration de Gram.

• On stérilise rapidement dans la flamme du bec une lame neuve
• On prélève de façon stérile, à l’aide d’une anse de platine, une goutte de culture bactérienne qu’on étale en film mince.

•  On recouvre la lame d’une lamelle.
•  L’observation se fait ensuite à l’objectif x40 ou à immersion (x100). Dans ce dernier cas, on dépose auparavant une petite goutte d’huile à immersion au centre de la lamelle. L’objectif doit être en contact avec l’huile.

En microbiologie, une préparation à l’état frais consiste à enfermer entre lame et lamelle une suspension de micro-organismes vivants. Il convient de réaliser une préparation correcte (sans déborder) afin de limiter la diffusion des microorganismes dans l’environnement du laboratoire.Cette méthode permet l’étude microscopique des bactéries vivantes, en l'absence de toute fixation ou coloration. permet aussi d'observer la morphologie des bactéries,le mode du groupement, la mobilité, la densité ou proportion de chaque microorganisme en cas de mélange.

• On prélève de façon stérile, à l’aide d’une anse de platine, une goutte de culture bactérienne qu’on étale en film mince.
•  On sèche le frottis en l’agitant au-dessus de la flamme du bec.
• On verse sur la préparation quelques gouttes d’alcool à 90°.

• On passe la lame 3 à 4 fois dans la flamme du bec bunsen, la lame étant tenue par une pince.
• On laisse refroidir la lame avant de commencer la coloration de Gram.

• On plonge la lame dans le flacon 1 contenant le violet de gentiane (= colorant de Gram) et on  laisse agir 45 s.
• On jette le colorant, on chasse ce dernier par quelques gouttes de la solution de Lugol qu’on laisse 10s “on refait la même chose trois fois (10s+10s+10s).
• On jette le lugol et on fait laisser couler en haut de la lame quelques gouttes d’un mélange alcool-acétone sur la préparation puis on arrête la différenciation très rapidement en lavant la lame sous l’eau courante dès que le frottis est décoloré (2 à 3 s).
• On replonge la lame dans le flacon 2 contenant la fuchsine de Ziehl et on laisse agir 45 s à 1 min, puis on lave à l’eau au-dessus du bac à coloration.
• Enfin, on sèche la lame au-dessus d’un bec bunsen.

[pic 1]

                   image  Bacilles Gram- et coques Gram+

Quant à la coloration de Gram, elle nous permet facilement de déterminer si les bactéries observées sont Gram (-) (elles abordent une coloration rose) ou Gram (+) (qui abordent une coloration bleue-violette). Cette coloration met en évidence les différents types de paroi des bactéries. Il existe deux structures de paroi permettant de différencier deux groupes de bactéries, les Gram+ et les Gram-. Dans les deux cas, la paroi contient un polymère complexe, le peptidoglycane. Chez les Gram -, la paroi comprend une fine couche de peptidoglycane entourée par une membrane externe de nature phospholipidique. L’alcool-acétone peut dissoudre ces lipides, traverser la fine couche de peptidoglycane et pénétrer dans le cytoplasme des bactéries qu’il décolore. La fuschine les colore secondairement en rose. Chez les Gram +, la paroi est composée d’une épaisse couche de peptidoglycane associée à des acides teichoïques. Elle est imperméable à l’alcool- acétone. La coloration violette des bactéries persiste.

1. Observation des colonies sur les différents milieux:

Une colonie est l'amas, visible à l’œil nu, constitué par des milliards de descendants d'une seule cellule bactérienne et dont la taille, la forme, la couleur, la consistance sont caractéristiques de chaque espèce.

L'étude de l'aspect des colonies nécessite l'observation à l’œil nu, en lumière naturelle et artificielle, par éclairage direct et par transparence des colonies.

Un milieu de culture est une préparation, contenant des substances (biologiques ou chimiques) qui reproduit un environnement (nutriments, pH, pression osmotique) permettant à certains types de micro-organismes de se multiplier.

Il existe une grande variété de milieux de culture qui sont utilisés pour produire, conserver, isoler ou identifier certains micro-organismes.

Voici ci dessous les résultats qu’on a trouvé suite à ces observations:

1. Test du type respiratoire pour la bactérie Gram+ : 

Afin de déterminer le type respiratoire de la bactérie Gram+ , on a fait le test sur gélose viande-foie qui est un milieu de culture ,principalement utilisé en tube profond , contient du glucose et des peptones de viande et de foie dans de l'agar à 6% .