Hplc

tué de silice greffée avec de l’octylsilane. C’est un support de microparticules avec des pores de 300A pour que le peptide puisse rentrer dans le gel. On crée un gradient d’élution en diminuant le pourcentage de TFA 0.1% et en augmentant l’acétonitrile ce qui permet de rendre la phase mobile de plus en plus apolaire pour éluer les molécules qui sont retenues par la phase stationnaire. La détection se fait à 214nm ce qui est très bas dans l’UV et donc permet de tout détecter, c’est pour cela qu’on peut obtenir des pics fantômes. D’après le nombre d’acides aminés hydrophobes dans la séquence étudiée, on peut dire que le peptide injecté est polaire. Le volume d’injection pour le peptide non digéré est arbitraire et celui du peptide digéré est de 150µL mais les volumes sont dans tous les cas très faible, de plus quand on en injecte un peu trop, le surplus est éliminé par la boucle. 2) HPLC- injection témoin : D’après le chromatogramme (annexe 1), on remarque qu’il n’y a pas de pics fantômes mais qu’il y a bien le pic d’injection à 0.750 minutes. On constate que la courbe à une faible pente qui augmente au fur et à mesure que le solvant B augmente au cours du temps et qui sera présente dans tous les autres chromatogrammes. 3) HPLC de la séquence C terminal du collagène XIV non digéré : Sur le chromatogramme en annexe 2, on observe deux pics : celui d’injection à Tr= 0.920 minutes et celui du peptide à Tr= 9.520 minutes. Cette HPLC nous permet de connaitre le temps de rétention (Tr) du peptide non digéré pour pouvoir le comparer aux autres chromatogrammes. 4) HPLC de la séquence C terminal du collagène XIV digéré : Annexe 3 D’après notre séquence : Ala-Val-Glu-Leu-Arg-Ser-Pro-Gly-Ile-Ser-Arg-Phe-Arg-Arg-Lys-Ile-Ala-Lys-Arg-Ser-IleLys-Thr-Leu-Glu-His-Lys-Arg-Glu-Asp-Ala-Lys-Glu, on constate qu’il y a plus d’acides aminés polaires (en bleu) que hydrophobes (en rouge) donc notre peptide est polaire. On a un pic à 9,58 minutes ce qui correspond au temps de rétention du peptide non digéré donc il en reste mais le pic est petit (environ 75 mAU) donc en faible quantité. Le peptide est digéré par l’α chymotrypsine qui coupe préférentiellement après les gros résidus et plus particulièrement après les acides aminés aromatiques, ici la phénylalanine en position 12. Il y a donc 2 fragments.

On a trois pics correspondant au pic d’injection (0,55 minutes) et celui contenant le tampon, le NaCl et le DTT (0.66 minutes) et un pour la PMSF (2,251 minutes) ce dernier est un peu polaire car il contient un cycle aromatique qui absorbe dans l’UV. De plus nous avons deux autres pics qui représentent les fragments du peptide digéré : un à 5 ,246 et l’autre à 7,714 minutes. Après analyse des deux fragments, on peut dire que le fragment 1 est moins polaire que le fragment 2 : - Dans le 1er fragment, on a 7 acides aminés hydrophobes sur 12 au total - Dans le 2ème fragment, on en a 5 sur 21 Or les composés plus polaires sont moins retenus par la colonne donc leur temps de rétention doit être plus petit que les composés moins polaires. Donc le pic à 5,246 correspond au fragment 2 et le pic à 7,714 au fragment 1. 5) HPLC après une chromatographie d’affinité : La colonne de la chromatographie d’affinité est composée d’héparine-sépharose, l’HPLC nous permet ici d’analyser l’éluat de la chromatographie d’affinité donc des composés retenus par l’héparine. On observe 5 pics sur le chromatogramme en annexe 4 : -le pic d’injection à 0,873 minutes -le pic du tampon NaCl à 0,958 minutes -un pic très faible à 2,381 qui semble correspondre à la PMSF car il a le même temps de rétention que dans le chromatogramme précédent. -un pic relativement élevé (environ 110 mAU) à 5,289 qui représente le fragment 2 par comparaison avec le temps de rétention de ce dernier dans l’annexe 3 -un pic très faible (environ 25 mAU) à 7,843 correspondant au temps de rétention du fragment 1 vu précédemment Donc le fragment 2 a une plus forte affinité pour l’héparine que le 1 car son intensité est plus élevée. Le collagène crée une interaction avec l’héparine grâce à la séquence du fragment 2. Remarque : On observe des très petits pics sur les différents chromatogrammes toujours à peu près aux même temps, ce sont des pics fantômes qui semble correspondre à la pente vu dans le blanc donc dû au solvant B.

IV- Conclusion :

L’α chymotrypsine clive cette séquence peptidique en 2 fragments de polarité suffisamment différente pour être séparé grâce à une HPLC. Cette enzyme protéolytique coupe préférentiellement les liaisons peptidiques après un acide aminé aromatique, ici c’est la phénylalanine. Le collagène XIV peut interagir avec la chaîne de GAG grâce à la séquence C terminale située après le résidu phénylalanine (fragment 2), c’est donc le site actif du peptide synthétique.

V- Annexes :

1°) Le solvant A doit être polaire et le peptide doit être soluble dans celui-ci, le B est moins polaire que le A et lui aussi, permettre au peptide d’être soluble. De plus, les solvants doivent être miscibles pour pouvoir former un gradient. Ils ne doivent pas non plus être trop visqueux pour pouvoir passer dans les capillaires qui sont très fins (acétonitrile