Tp Specificite Des Actions Enzymatiques: Les Glycosidases

+ H2O

Dans le cas des sucres, il y a pouvoir réducteur seulement si le OH anomérique est libre. Donc si une solution de sucre devient rouge en présence de liqueur de Fehling c’est que le OH anomérique du sucre en solution n’a pas été substitué ou engagé dans une liaison.

CCM

La technique de la chromatographie sur couche mince se base sur la différence de solubilité des composés induite par des jeux de polarité entre les molécules. Dans notre cas, la phase mobile est un solvant très polaire, l'acétone qui migre par capillarité dans la phase stationnaire: une plaque de silice qui est un composé polaire (mais moins polaire que la phase mobile). L'affinité avec la phase stationnaire diminue donc avec la polarité et le solvant étant plus polaire, la distance de migration augmente lorsque la polarité augmente.

En comparant les rapports frontaux des différents tubes avec ceux des témoins, le principe est le suivant: si les rapports frontaux sont significativement identiques, on déduit qu'il s'agit de la même molécule.

Les rapport frontaux : Rf=h/H correspondent à la distance de migrations des molécules divisé par la distance de migration du front du solvant. Ce rapport frontal est donc caractéristique d'une espèce chimique.

III – Résultats et interprétations :

Chromatographie :

Légendes du chromatogramme:

Dépôt 1 – D-Glc

Dépôt 2 – D-Gal

Dépôt 3 – D-Fru

Dépôt 4 – Tube 1 : Diholoside + Tampon pH 4,8 (témoin négatif)

Dépôt 5 – Tube 2 : Diholoside + Tampon pH 4,8 + bêta-D-Fructosidase

Dépôt 6 – Tube 3 : Diholoside + Tampon pH 4,8 + bêta-D-Glucosidase

Dépôt 7 – Tube 4 : Diholoside + Tampon pH 6,4 + alpha-D-Glucosidase

Dépôt 8- Tube 5 : Diholoside + tampon pH 7,2 + bêta-D-Galactosidase

Dépôt 9 – Mélange D-Glc + D-Gal + D-Fru

Dépôt | glucose | galactose | fructose | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | mélange |

Distance de migration (cm) | 2,0 | 1,3 | 3,6 | 0,7 | 0,7 | 0,7 | 0,7 1,9 | 0,8 | 1,4 2,1 3,3 |

Rapport frontal | 0,28 | 0,18 | 0,5 | 0,10 | 0,10 | 0,10 | 0,10 0,27 | 0,11 | 0,19 0,29 0,46 |

Le front de migration est de 7,2cm.

Le fructose témoin migre plus que les deux aldoses témoins, cela s’explique par la présence de la fonction cétone qui augmente la polarité. En effet nous avons utilisé un solvant polaire (acétone-eau) il est donc normal que la distance de migration augmente avec la polarité.

Le dépôt de mélange de sucre permet de vérifier que les sucres ne s’associent pas entre eux ou ne se modifient pas lorsqu’ils sont plusieurs en solution, en effet on obtient trois taches différentes correspondant aux trois dépôts témoins pour la solution de mélange des trois sucres témoins.

Les dépôts 1, 2,3 et 5 ne présentent qu’une seule tache: il n’y a donc pas eu de réaction avec les enzymes ajoutées. La tache correspond donc au maltose, la faible distance de migration s’explique par le fait que lorsque la taille d’une molécule augmente, sa vitesse de migration diminue.

Le rôle du dépôt 1 (témoin) est de vérifier que l’hydrolyse de la liaison osidique est bien due aux enzymes et non pas au pH. Cela se confirme car il n’y a qu’une seule tache pour ce dépôt et elle correspond au maltose.

Le dépôt 4 provient de la solution de diholoside avec de l’α-D-glucosidase. Il a formé deux taches : l’une correspondant au maltose (car la réaction n’était pas totale) et l’autre correspondant au glucose.

L’alpha-D-glucosidase étant la seule enzyme agissant sur le diholoside et le produit de cette hydrolyse étant (seulement) du glucose, il est donc possible de déduire que le diholoside est composé de deux molécules de glucose. Les enzymes n’agissant que sur des sucres ayant leur OH anomérique engagés dans une liaison osidique on peut en déduire les formes possibles pour le diholoside :

α–D-glucopyranosyl(1 -> 4)β-D-glucopyranose

α–D-glucopyranosyl(1 ->4)α-D-glucopyranose

α–D-glucopyranosyl(1 ->1) α–D-glucopyranoside

α–D-glucopyranosyl(1 ->1)β-D-glucopyranoside

(car pour ce TP on considère que seule la fonction alcool en position 4 peut être impliquée dans la liaison osidique, et que le glucose se trouve sous sa forme cyclique la plus stable).