Tp Thrombine

ement, rajouter une goutte, fermer le tube, etc... Remuer par retournement pendant 10 minutes après l'ajout de BaCl2. Centrifuger 10 minutes à 6000 tpm, et récupérer le surnageant délicatement sans emmener le culot en versant directement dans un tube propre marqué « S1 ». Dilution à 1:9 de la solution saline « SS », 300 µ L final : – Dans un tube Eppendorf :30 µ L « SS » + 270 µ L H2O Ressuspendre le culot avec cette dilution de « SS », homogénéisez. Aliquoté 20 µ L du culot ressuspendu dans un tube Eppendorf appelé « C1 » pour en mesurer l'activité ultérieurement (conserver sur la glace).

c-Deuxième précipitation :

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Reprécipiter la suspension avec 80µ l de BaCl2 1M en goutte à goutte (comme précédemment) puis remuer par retournement pendant 10 minutes. Laisser poser dans la glace 1 heure minimum. (Pendant ce temps réaliser les mesures d'activité sur les aliquote Pl, S1 et C1) cf. partie Id. Centrifuger 10 minutes à vitesse maximum. Récupérer le surnageant délicatement sans emmener le culot, dans un tube propre noté « S2 ».Vous en mesurerez l'activité ultérieurement. Resuspendre le culot dans 120 µ L d'EDTA 0,2M pH 7,4 froid Aliquoté 20 µ L du culot ressuspendu dans un tube Eppendorf appelé « C2 » pour en mesurer l'activité ultérieurement (conserver sur la glace). Sur le reste de la suspension mettre en place une dialyse. A cette étape, la dialyse doit normalement durer plusieurs jours...

d-Dilutions des aliquotes pour les mesures d'activités : Tampon d'activité : tris -Hcl 50 mM pH8 ; 300 mM NaCl plasma sanguin – diluer la suspension au 1/20ème dans du « Tampon d'activité » (tube « pl ») ==> 50 µ L de plasma + 950 µ L de tampon – utiliser 50µ l pour le test d'activité (annexe 1) surnageant S1 – diluer du surnageant au 1/10ème dans « Tampon d'activité » ==> 50 µ l de « S1 » + 450 µ l de tampon – utiliser 50 µ l pour le test d'activité culot resuspendu C1 – Diluer les 20 µL de « C1 » au 1/40ème dans du « Tampon d'activité » – ==> 20 µL de « C1 » + 380 µL de tampon – utiliser 50µ l pour le test d'activité surnageant S2 – diluer 50 µL du surnageant au 1/10ème dans du « Tampon d'activité » – utiliser 50 µ l pour le test d'activité culot resuspendu C2 – Diluer les 20 µL de C2 au 1/40ème dans du « Tampon d'activité » – utiliser 50 µ l pour le test d'activité

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e-Mesures d'activités : Cf Annexe 1 Tampon d'activité : tris -Hcl 50 mM pH8 ; 300 mM NaCl Solution d'Ecarine (toxique !) Substrat S1 à 0,25 mM

II-Chromatographie échangeuse d'ions : Il s'agit de la dernière étape de purification de la prothrombine à partir du sang (cf Annexe 2). Tampon 25 mM trisodium-citrate pH 6 Tampon 25 mM trisodium-citrate, 0,15M NaCl pH6 Tampon 25 mM trisodium-citrate, 0,5M NaCl pH6 a-Equilibre :

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Abaisser le volume de tampon à environ 2mm au dessus du niveau du gel. Coupez le flux. Équilibrer la colonne de chromatographie échangeuse d'ions DEAESephadex A-50 en faisant passer 30 mL du tampon trisodium-citrate 25mM pH 6 (même tampon que celui de l'échantillon « Pro » donné) à travers la colonne.

b-Dépot :

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Sans sécher la colonne, abaisser le niveau du tampon à 1mm au dessus du gel Commencez à collecter des fractions de 1000 µ L dans des tubes Eppendorf. Numérotez les ! Déposez sur la colonne 100 µ L de l'échantillon protéique « Pro » qui vous est donné. Remettre le flux doucement, afin de faire passer l'intégralité du dépôt dans la colonne, puis dès que le dépôt est passé commencer le lavage en ajoutant du tampon (trisodium-citrate 25mM pH 6) mL par mL. Veillez à ne pas sécher le gel.

c-Poursuite du lavage :

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Le