Enzymes synthèse biochimie

Chapitre 3 : Les enzymes

OBJECTIFS :

• Expliquer le rôle et le fonctionnement d’un enzyme dans la catalyse ;
• Déterminer les paramètres KM et Vmax à partir des données d’une cinétique ;
• Déterminer l’activité spécifique d’un enzyme à partir des données d’une cinétique ;
• Reconnaître une inhibition compétitive d’une inhibition non-compétitive, expliquer la structure et le mode d’action des inhibiteurs ;
• Comparer une cinétique michaelienne et allostérique.

1. Définition

Les enzymes sont des catalyseurs biologiques spécifiques des réactions biochimiques. Tous les enzymes sont des protéines.

Certaines réactions sont spontanées (ne nécessitent pas d’apport énergétique extérieur) mais ne sont pas instantanées :

Saccharose + H2O → Glucose + Fructose

Le complexe enzyme – substrat

Composés qui entrent en réaction = substrats (S).

Molécules issues de la réaction = produits (P)

L’enzyme a une forme adaptée à son substrat, ce qui permet la formation d’un complexe enzyme-substrat (ES)

[pic 1][pic 2]

La liaison entre l’enzyme et le substrat se fait par des liens non covalents et l'on constate une complémentarité entre le site actif de l'enzyme (où vient se fixer le substrat) et le substrat.  On utilise dès lors fréquemment l'analogie entre la clé (substrat) qui se fixe exclusivement dans la serrure (enzyme) complémentaire.  

Or, une molécule d’enzyme n’est pas rigide, mais flexible 🡪 il y a donc le modèle de l’ajustement induit : comme la main et le gant.

Le site actif est en général formé par des parties différentes de la séquence.[pic 3]

• Enzyme de reconnaissance d’infections bactériennes

1. Classification des enzymes

[pic 4]

Le 1er chiffre signe l’appartenance à l’une des 6 classes d’enzymes :

[pic 5]

Le 2e chiffre signe l’appartenance à une sous-classe.

Dans la classe 1, la sous-classe indique la nature du donneur d’électrons : groupement -C-OH ‘sous-classe 1), groupement -CHO ou -CO (sous classe 2), etc. Dans la classe 2, la sous classe indique la nature du groupement transféré.  Dans la classe 3, la sous-classe indique la nature de la liaison hydrolysée.  Dans la classe 4, la sous-classe indique la nature de la liaison coupée.  Dans la classe 5, la sous-classe indique le type d’isomérisation.  Dans la classe 6, la sous-classe indique la nature de la liaison créée.

Le 3e chiffre signe l’appartenance à une sous-sous-classe. Par exemple, dans la classe 1 et la sous-classe 1, la sous-sous-classe indique la nature de l’accepteur d’électrons.

Le quatrième chiffre est un numéro d’ordre dans la sous-sous-classe considérée.

[pic 6]

1. Propriétés des enzymes

• Efficacité : réaction 103-1017 fois plus rapide que la réaction non catalysée
• Non-consommation : régénération de l’enzyme en fin de réaction donc intacts à la fin de la réaction
• Rentabilité : enzyme en concentration faible
• Spécificité : enzyme capable de reconnaître un seul réactif (=spécificité absolue) ou type de réactif (=spécificité restreinte)
• Fragilité : dénaturation de la structure protéique tertiaire (chaleur, pH, détergents, …)

1. La cinétique enzymatique

Activité spécifique :

Activité enzymatique = mesure de l‘effet catalytique d’une enzyme basée sur la quantité de substrat (µmol) transformée par unité de temps (min) = unité internationale (U.I)

On rencontre aussi le katal : quantité de substrat (mol) transformé par unité de temps (sec)

Activité spécifique : activité enzymatique pour 1 mg d’enzyme

Si masse molaire de l’enzyme connue, l’activité spécifique s’exprimera en : μmol.min-1.μmol -1 et prendra donc les dimensions d’un temps -1. C’est une constante pour une enzyme donnée, dans des conditions de pH, température et de force ionique = constante catalytique = nombre de molécules de substrat transformées par unité de temps = kcat ou turnover

Application :

[pic 7]

La vitesse initiale de réaction

Soit la réaction catalysée par l’enzyme E qui transforme le substrat S en produit P : 

[pic 8][pic 9]

La vitesse peut être mesurée par :

Le signe moins dans –d[S]/dt traduit le fait que la concentration de S diminue alors que celle de P augmente.[pic 10]

v0 = pente de la droite à l’état stationnaire (M.s-1 ou µM.s-1)

Les courbes d’apparition du produit en fonction du temps pour des concentrations [E] et [S] données présentent plusieurs phases :

• d’abord linéaire ascendante : l’enzyme est saturée par son substrat, la vitesse est constante (état stationnaire) ;
• puis s’infléchit : l’enzyme n’est plus saturée par son substrat, la vitesse décroît ;

• et enfin devient horizontale : l’équilibre de la réaction est atteint et la vitesse est nulle.

Influence de la concentration en substrat

[pic 11]

• A l’instant t = 0, dans les tout premiers instants de la réaction, la vitesse est maximale, c’est la vitesse initiale (notée v0).  La vitesse initiale est déterminée en calculant la pente de la droite obtenue en traçant la tangente à la courbe.
• La dimension de la vitesse est une concentration par unité de temps, l’unité est (M.s-1), toutefois les biochimistes ont l’habitude de prendre des μmole/L par minute (μM.min-1).
• Pour une concentration en enzyme [E] constante, plus la concentration initiale en substrat [S] augmente, plus la vitesse initiale est importante.  Au-delà d’une certaine concentration en substrat la vitesse initiale n’augmente plus, elle atteint un maximum (vmax).  Cette relation entre vitesse initiale et concentration en substrat est décrite par l’équation de Michaelis-Menten

Équation de Michaelis-Menten

Au début du XXe siècle, des chercheurs étudiaient l’influence des variations de concentration de substrats, dans le but de formuler des équations de vitesse représentant les processus enzymatiques.

C’est ainsi que Leonor Michaelis (médecin et biochimiste allemand) et Maud Menten (médecin canadienne) fournirent la relation permettant de décrire l’évolution de la vitesse initiale (v0) en fonction de la concentration en substrat :[pic 12]

L'équation obtenue est appelée équation de Michaelis-Menten.  Elle nous apprend que la vitesse initiale d'une réaction enzymatique (v0) dépend de la concentration en substrat, de KM (constante de Michaelis-Menten qui représente une concentration) et de Vmax, vitesse maximale que la réaction peut atteindre.

Si nous représentons graphiquement cette équation : v0 = f([S]), nous obtenons une hyperbole

[pic 13]

Signification des constante Km et vMax :

• Si [S] est très faible et donc nettement inférieure à KM , la valeur de [S] devient négligeable par rapport à KM .  Nous pouvons dès lors réécrire l’équation de M-M comme suit : [pic 14]

• La vitesse ne dépend plus que de la concentration en S (KM et Vmax étant des constantes).  L'évolution de la vitesse est donc directement proportionnelle à [S] pour de faibles concentrations en substrat.  Nous visualisons donc sur le graphe une portion linéaire pour [S] petite

• Si [S] est très élevée et donc nettement supérieure à KM, la valeur de KM devient négligeable par rapport à [S] et l’équation de M-M peut être réécrite comme suit :

V0 = Vmax

La vitesse est ici égale à une constante, Vmax , et ne dépend absolument plus de [S].  Sur le graphe, nous visualisons donc un plateau pour [S] élevée.

Ce plateau représente la saturation de l'enzyme en substrat : même si on rajoute S, la vitesse de la réaction ne pourra plus augmenter.  Nous voyons donc que lorsque l'enzyme est entièrement saturé en substrat, la vitesse de la réaction atteint une vitesse maximale appelée Vmax.