Chromatographie

n

1.2 Pompe

Ø Ø Fonctionne / piston alternatif (svt à pls pistons) à Assure un débit cst Appareil à gradient de polarité : o syst de vannes EM proportionnelles qui permet les mélanges des solvants en amont d’une pompe unique (ces vannes s’ouvrent en tps proportionnel) Qualités : -pas de pulsation -résiste à la corrosion -débit constant

Ø

Schéma Huguette gradient de PM

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Section 2 item 5 1.3 Dispositif d’injection

Ø Ø Ø Injection manuelle ou automatique avec un passeur d’ech P° élevée en tête de colonne dc impossible d’injecter à la seringue comme en CPG Syst d’injection particulier à Injecteur à boucle : o vanne à boucle d’échantillonnage ,commandé manuellement o Vol : 1 à 100µl o Assure des injections très répétables o Ces boucles ont des volumes variables o La boucle peut être mise en communication par des vannes avec le réservoir de ϕm et la colonne

Ø Ø Ø Ø

Remplissage de la boucle à P° atm Le trop plein est rejeté vers l’ext Pdt cette étape , la ϕm circule en permanence sur la colonne. Puis injection du contenu de la boucle en tournant la vanne d’injection ,la ϕm est mise en communication avec la boucle et la colonne

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Section 2 item 5 1.4 Les colonnes

Ø Ø Ø Ø Tubes droits en acier inoxydable 5 à 30 cm de long 3 à 4.6 mm de ∅ interne (auj ,∃en a de 2 mm) qlq fois , on place en amont une colonne de garde =petite colonne courte (1 à 2 cm ) remplit avec la même ϕs que la colonne analytique

1.5 La phase stationnaire (voir type de chromato correspondante)

Ø Ø Située dans la colonne 2 types de PS : o PS imprégnées : § Phase solide de silice retenant à sa surface les composés § Surtt utilisé en chromato d’adsorption (S/L) o PS greffées +++ § Formées par formation de liaisons covalentes entre les gpt silanols de la silice et des molécules organiques de nature variées § Le plus courant = diméthylchlorosilane § Les carac de la PS greffée sont déterminées par la nature du gt gréffés § Mais 50 des silanols ne seront pas greffées (encombrement stérique) à Pics dyssymétrique § Bonne efficacité, mais utilisable qu’entre ph2 et 8

Ø Ø

Ø

Constituée de grains de 3 à 10µm de ∅ de nature poreuse Cette ϕs dpd des séparation à réaliser -silice -silice greffée de gpmts polaires ou apolaires ,échangeur d’ion ou gel -zirconium (moins bonne efficacité mais utilisable entre pH1 et 12) Cette ϕs est retenue ds colonne par des disques poreux (frittés ) aux 2 extrémités de la colonne

1.6 Les détecteurs

Ø Ø Ø Doit fournir une réponse qui reflète en continu les variations de compo de l’éluat à la sortie Choix en fct° des composés à analyser Qualités requises : o linéaire = réponses proportionnelles à la conc à chaque instant o sensible o réponse rapide, reproductible, et stable ds le tps o peu de bruit de fond (variation aléatoire de la ligne de base) o limite de détection faible compatible vec les résultats attendus o Volume mort le plus réduit possible a- spectrophotométrie +++ Ø Le + courant pour les composés qui absorbent ds UV-visible (doubles liaisons) o soit directement (si gpt chromophore) o soit après dérivation § soit pré colonne § soit post colonne on mesure l’absorbance à 1 ou pls λ La ϕm ne doit pas absorber à cette λ Ces détecteurs peuvent être ut en gradient d’élution Régi par la loi de Beer-Lambert : A=εLC

Ø Ø Ø Ø

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Section 2 item 5

NB : 2 substances à des conc ≠tes peuvent donner une même auteur de pic (dpd ε) a-1. détecteur monochromatique (spectrophotométrie) Ø Ø Ø Ø Ø source UV-visible →syst monochromateur (λ max)→ L=trajet optique de la cuve (c* à µ circulation)=ϕm →détecteur (photomultiplicateur ou photodiode) ⇒permet analyse quantitative →chromatogramme à λ choisie →ne permet pas de tracé spectre instantanément ,tracé point à point :λ1→Aire 1 ,λ2→aire 2... le spectre enregistré est celui ds la ϕl càd identique à celui pris en dissolvant l’ech ds ϕm

a-2. détection polychromatique (détecteur à barrette de diodes) Ø permet enregistrer les signaux à ttes les λ instantanément Ø source polychromatique traverse c* de mesure en permanence Ø absorbe +/- en fct° des propriétés Ø à la sortie ,∃ réseau (polychromatique ) qui disperse les λ Ø l ’intensité à chaque λ est enregistrée sur une barrette de diode Ø chaque diode enregistre ds un petit domaine de λ →info en 3D A en fct° du tps et en fct° de λ A=f(T)→spectre du composé au tps T (qualitative) A=f(t) à λ donnée →chromatogramme ⇒info qualitative (spectre) et quantitative (calcul des aires) b- spectrofluorimétrie substances fluorescentes (directement ou après transformation chimique) =m* planes ,rigides à doubles liaisons conjuguées ème I=Kc →analyse quantitative (cf. fluorimétrie 2 année) Source UV→λ excitation sélectionnée / filtre ou monochromateur →c* à la sortie de la colonne →λ d’émission (filtre) →photomultiplicateur Avantages : -très sensible -très sélectif

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Section 2 item 5

peu ut ds analyse pharma , srtt en analyse bio et en analyse environnementale après transformation en général (seulement 5% des substances sont fluorescentes) c- détecteur réfractométrique basé sur mesure en continue de l’indice de réfraction de l’éluant réponse basée sur la ≠ce d’indice de réfraction vs éluant (n) et ϕm (no) détecteur universel :répond à ts les composés ) peu sensible non utilisable en gradient d’élution (variation de l’Ir (indice de réfraction) de la ϕm très sensible aux variations de T° (fluctuation de la réponse assez peu ut (srtt substance qui n’absorbent pas ds UV ) →analyse des sucres d- détecteur conductimétrique basé sur la conductivité des ions proportionnelle à leur conc →analyse des ions e- détecteur électrochimique basé sur la prop d’un composé à être oxydé ou réduit par une électrode portée à un potentiel donné très délicat à employer ut pour analyse des catécholamines : absorbent peu ds UV facilement oxydables à l’électrode f- spectrométrie de masse permet d’identifier composé par leur spectres de masse ,coûteux mais très sensibles ut en pharmacocinétique pour identifier métabolites ut ds centres de recherche pour identifier les impuretés

g- Autres -IR -Radioactivité -Polarimétrie -chimioluminescence

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Section 2 item 5

2 Différents types de chromatographie

2.1 Chromatographie d’adsorption

Ø Ø Ø Ø Ø Ø Ø Ce mode de chromatographie met en jeu un mécanisme d'adsorption du soluté sur la phase stationnaire solide et un mécanisme d'élution (désorption) par la phase mobile (éluant). Adsorption = Solide – liquide PS = silice (alumine + rarement) =a bsorbant (solide) SiO2→caractère acide très polaire Ut pour traité composé à caractère basique Gel de silice ,réseau 3D 3 types de sites : o silanols (OH) libres o silanols liés /LH o ponts siloxanes o silanols libres hydratés o gel de silice fortement hydratés les sites actifs qui réagissent sont les silanols libres et silanols libres faiblement hydratés et liés /LH selon l’état d’hydratation de la silice ,les sites sont ± bloqués à la surf ,∃ compet vs m* de soluté et m* de solvant de la ϕm ce sont les solutés polaires qui vont se fixer solvant site

Ø Ø Ø Ø

soluté

SA Surf de silice a- Méca d’adsorption (compet sur SA) Ø Ø Ø Ø ou partage vs eau fixée sur site et ϕm →chroma de partage la fixation se fait avec énergie d’adsorption forte des composés polaires sur les sites actifs silanols libres (- forte sur silanols liés ,libres avec une m* d’H2O) c’est l’eau qui contrôle l’activité de ces SA b- Rétention et règle d’élution Ø Rétention fct° : o du soluté : § nrj d’adsorption des gpmts fonctionnels § encombrement stérique o de l’adsorbant : § surf spécifique § granulométrie § porosité § teneur en eau (activité) du solvant : § forme éluante :solvants classés d’après leur force d’élution vis à vis de la ϕs § elle suit la polarité pour la chromato d’adsorption

o

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Section 2 item 5

◊ solvant faible :déplacement difficile du soluté fixé sur SA ◊ solvant fort : déplacement