Séparation de lipides par chromatographie

SEPARATION DE LIPIDES PAR CHROMATOGRAPHIE

But du TP : Séparer les lipides présents dans les différents tissus, le plasma et les globules rouges prélevés chez le rat par chromatographie en couche mince.

1. Principe

La chromatographie en couche mince utilise, comme la chromatographie sur papier, le transfert d’une substance d’une phase vers une autre : l’une est fixe ou stationnaire, l’autre est mobile. Ce type de chromatographie fait intervenir la notion de partage mais les phénomènes d’adsorption sont aussi très importants.

Le support est étalé en une couche très mince sur une plaque de verre ou de plastique. Ce gel est souvent un sel, un oxyde ou un hydroxyde. Il possède généralement un fort pouvoir adsorbant vis-à-vis des produits organiques. En série aliphatique, les groupements fonctionnels permettant l’adsorption sont par ordre décroissant : acide, amide, alcool, éther, amine tertiaire et halogène.

L’équilibre entre support, solvant et substances à chromatographier est schématisé dans la figure ci-dessous.

[pic 1]

B) Méthodologie

B.1) Choix du support

Il est déterminé par le pouvoir adsorbant vis-à-vis des substances à chromatographier. Les substances les plus utilisées sont les gels de silice adsorbants puissants à réaction acide ou les sels d’alumines qui sont des adsorbants moyens. Il est possible de modifier les propriétés des supports en modifiant leur degré de division ou d’abaisser leur pouvoir d’adsorbant en augmentant la teneur en eau.

B.2) Choix du solvant 

Le solvant utilisé est un solvant organique pur ou un mélange de solvants. Si une substance migre avec le front de solvant, il est possible de diminuer sa migration en augmentant le pouvoir adsorbant du support ou en diminuant la polarité du solvant. A l’inverse, lorsqu’une substance ne migre pas dans un système donné, il est possible d’augmenter sa migration en augmentant la polarité du solvant ou en diminuant le pouvoir adsorbant du support.

B.3) Enceinte de migration

Les cuves dans lesquelles sont effectuées les migrations sont des parallélépipèdes en verre, hermétiquement fermés par un couvercle. Leur atmosphère doit être saturée par les vapeurs du solvant. Une saturation défectueuse produit des effets de « bords » dus à une évaporation du solvant plus rapide sur les bords des plaques.

B.4) Technique

Les plaques de chromatographie sont conservées à l’abri de l’humidité. L’eau diminuant le pouvoir adsorbant du support, on élimine cette eau résiduelle en chauffant les plaques à 120°C.

Le dépôt des produits à étudier s’effectue avec des micropipettes qui permettent de faire des spots de petites dimensions. Le dépôt est alors séché.

L’enceinte ayant été préalablement saturée avec les solvants, la plaque est placée verticalement dans la cuve. Après migration, on retire la plaque et on la sèche avant révélation.

B.5) Résultats

La forme des spots dépend de la qualité du dépôt. Les traînées sont souvent dues à une surcharge des dépôts, à trop de sels ou à un support irrégulier.

Rf = rapport entre la distance de migration de la molécule et celle du solvant (toujours ≤ 1).

Rf dépendant de nombreux facteurs (tels que l’épaisseur et l’humidité du support, la saturation de la cuve…), on utilise des témoins de migration.

C) Réactifs

Plaques de silices

Hexane

Ether

Acide acétique

Acétone

Méthanol

Acétate de méthyle

Eau

Chloroforme

Propanol

Solutions de standard de lipides

        Standard : EC, TG, C, PE, PC, SM

D) Manipulation

Préalablement au TP : Activer les plaques de silice 20 min à 100°C.

Chromatographie monodimensionnelle avec double développement

Solvant : acétate de méthyle, chloroforme, propanol, méthanol, eau