Chromatographie

Cours 1 (extraction et analyses électrophorétiques des biomolécules)

Les biomolécules ont 4 grandes familles : Glucides, Lipides, Protéines et les acides nucléiques.

Suivant la classe des biomolécules, elles sont dans une cellule donnée, il va falloir choisir la bonne cellule laquelle on veut extraire notre biomolécule donc la choix de la source est très importante, il faut choisir qqch produire assez ces molécules et de laquelle, il faut faire l’extract facilement ces molécules. Donc il faut une cellule facilement à cultilver, une cellule facile à lyser, etc, … La deuxième étape de protocole c’est l’extraction, une fois que la biomolécule sera sortie de la cellule, elle sera dans une solution, il faut la rassembler et la mettre en place de l’étape d’extraction. Deux séparations de notre molécule de la cellule, ce sera l’étape de purification et enfin l’analyse qui sera d’elle parallèlement à la séparation poursuivre de différents étapes de la purification. Donc la biomolécule au départ est dans la cellule lorsqu’on l’extrait, elle sera en solution, elle s’est évidemment diluée et le but après la purification c’est de l’obtenir concentré, séparé le plus possible des contaminants cellulaires.

On a 2 façons d’extraire cellulaire qui existent : soit on prend un contexte naturel de cette biomolécule par exemple, on veut extraire certains sucres, on va utiliser évidemment des plantes qui produisent notamment les saccharoses, on choisit la cellule qui surexprime le mieux la biomolécule plus on veut récupérer. On a un autre moyen si jamais on connait bien cette molécule, on peut aussi l’exprimer de façon artificielle dans une cellule donc on maîtrise pas parfaitement le développement. Donc dans ce cas là, la biomolécule est exogène à la cellule, c’est pas son environnement naturel, on peut ainsi exprimer donc c’est souvent faire avec des protéines par ex c’est le cas de l’insuline, on appelle dans ce cas là la protéine produite une protéine recombinante ça veut dire qu’elle n’est pas exprimée de façon naturelle dans la cellule de laquelle on va extraire. Donc on va faire introduire avec un vecteur d’expression (plasmide, …) qui contient le gène qui code pour cette protéine dans la cellule d’intérêt ça peut être une levure avant qui se produit très facilement (11 :00), la levure ainsi travailler va pouvoir produire cette protéine que l’on peut ensuite extraire. En plus, on veut la modifier pour associer à cette protéine une petite étiquette par ex une succession de cys-histidine, cette petite étiquette pourrait utiliser dans certaine phase de purification. Les cys-histidine ont a des anticorps totalement spécifiques de ces cys-histidines et on peut créer des colonnes qui l’accrochent pour que les protéines ayant cette étiquette cys-histidine. Si on a pas de vecteur, on a aussi un produit directement les ARNs qui codent pour chaque protéine donc on a produit les ARN directement dans la cellule et là encore, la protéine peut être synthétisée dans la cellule et on pourra ensuite récupérer cette protéine. L’avantage de ce contexte artificiel c’est qu’on maîtrise parfaitement la façon de la cellule et les étapes d’extraction. On peut surexprimer par rapport à un contexte naturel une biomolécule dans notre système.

Alors, une fois qu’on a choisi la cellule qui va nous permettre d’extrait notre biomolécule, il va falloir isoler cette biomolécule, pour ça on va faire une étape d’extraction qui va être une étape de récupation de tout ce qui a dans la cellule cad un extrait un peu total. L’objectif est d’avoir un échantillon le plus clair possible donc le moins contaminé par de différentes molécules qui contiennent la molécule d’intérêt qui va être compatible avec les étapes de purification compatibles en terme de tampon, de sel, de pH et qui va permettre d’élimination des contaminants cad on va déjà par l’étape d’extraction, faire une première fragmentation de ce qui contient la molécule pour pouvoir avoir déjà des grandes familles et ensuite pour aller plus finement purifier la protéine intérêt. Le choix de l’étape d’extraction va dépendre de différentes choses, elle dépend des caractéristiques de la molécule que l’on recherche, de sa localisation est-ce que la molécule est cytoplasmique, nucléaire ou dans l’autre organite et ça aussi dépend de la cellule, si c’est une cellule végétale, si c’est une cellule animale et l’étape d’extraction ne sont pas les mêmes.

L’extraction c’est d’abord déstabiliser la membrane pour que l’eau puisse entrer à l’intérieur de la cellule et puis la cellule va gonfler, elle va éclater et libérer le contenu dans la lyse cellulaire. C’est différent si on prend de la natures de la cellule, on peut aussi mélanger cette technique, souvent on associe plusieurs techniques à la fois pour être la plus effice. La plus simple c’est la lyse mécanique, on va faire des chocs sur notre membrane donc pouvoir en broyant grâce à un mortier donc ça s’est fait souvent avec les cellules végétales, on peut y mettre des ultrasons au niveau de cellule, ça va déstabiliser la membrane donc ça on appelle la sonication, pour faire des trous dans la membrane on peut jouer sur la pression alors tout ça sonication, pression, … sont plutôt associés aux cellules de types levures donc soit on joue sur la pression, là on va faire passer à travers un énorme appareil qui s’appelle French press de la haute pression, cad les cellules vont passer à travers à un tout petit tuyau, la pression est tellement forte, elle va déformer la cellule jusqu’à en face l’écraser. On peut jouer avec des billes donc on fait ça quand on travaille avec toute petite quantité, évidemment ces billes mécanique vont s’adapter selon le volume de cellule que l’on devra travailler. En industrie, on ne travaille pas avec un moulin à billes, un moulin à billes c’est juste mettre de petites billes à verre dans un tube et vortexer de façon régulière donc faire en sorte que les billes sans trop choc. Elles sont bien sûr mélangées à la culture de cellule et donc ça va faire des chocs sur la membrane et donc déformer la membrane. En industrie, on préfère la congélation / la décongélation, le froid, le chaud jouent aussi sur cette membrane et ça va faciliter de la stabilisation. Alors, qu’est-ce qu’on va faire si on a d’autres types de cellules ? Et bien, on va pouvoir faire des lyses enzymatiques, ça peut être soit associé à la lyse mécanique soit être indépendemment, enzymatique ça veut dire dans notre culture on va ajouter une enzyme, cette enzyme va dégrader la membrane. Alors pourquoi on doit faire avec différents enzymes ? C’est parce que les parois autour de membrane sont différents, si on a des cellules végétales, des bactéries, des champignons, ça peut être différents par ex les bactéries au niveau de leur membrane, elle contient de peptidoglycane (le gram +), pour le gram – il y a une autre membrane au-dessus si on a des gram + c’est facile on va jouer sur ce peptidoglycane et rajouter au milieu une ezyme le lysozyme qui va digérer le peptidoglycane. Par contre, si on a des gram – il faut au préalable déstabiliser la paroi qui est au dessus de cette membrane externe et pour ça on va jouer avec un tampon qui va déstabiliser cette membrane qui contient DPA (19 :56). On utilise la cellulase pour déstabiliser la paroi pectocellulasique des cellules végétales et le zymolase pour les levures. Enfin, la troisième façon de déstabiliser la membrane de cellule qui est très utilisé pour les cellules mammifères, les cellues sans paroi plutôt cellules animales comme les cellules humaines. Donc on va faire la lyse osmotique, la lyse osmotique se fait dans un tampon hypotonique ça veut dire faible en sel du coup par équilibre osmotique, entre le milieu intérieur de la cellule et le milieu extérieur, il y a un équilibre qui va se former et pour ce fait, il y a de l’eau qui va entrer à l’intérieur de la cellule et donc va faire gonfler la cellule, déstabiliser la membrane et donc éclater cette cellule. On peut aussi rajouter des détergents et de Triton, les détergents agissent directement sur les lipides.

Les lipides ont une structure insoluble dans l’eau et donc l’extraction qui va extrait à partir des tissus notamment va nécessiter d’utiliser des solvants. On prend les tissus par ex dans la foie que l’on va fragmenter, que l’on va découper en petits morceaux. Ce petit morceau est homogénéisé dans une solution qui contient de solvant, une solution que l’on a ajouté chloroforme/méthanol ou éthanol/eau. Les proportions ne sont pas à connaître mais si il faut qu’on sache c’est que dans la proportion les 3 composés sont miscible, ça doit être qqch homogènes et le principe de fragmentation entre des lipides et le reste des biomolécules cad entre les lipides et les protéines glucides c’est de séparer les phases : la phase méthanolique et la phase chloroforme. Au départ, on fait un mélange où les 3 liquides vont être bien miscibles, on rajoute de l’eau et en rajoutant en eau, on change en fait les proportions de chacun des composés et deux phases vont se former directement dans une ampoule, entrer dans avec elle soit d’un côté des protéines et des glucides cad les molécules qui sont polaires, ces molécules polaires vont aller vers la base qui contient aqueuse et les molécules apolaires, les lipides vont transformer par le chloroforme puisqu’ils sont asolubles dans l’eau. C’est une expérience importante et suivre ensuite par la chromatographie pour pouvoir adapter différents purifications fines qui va permettre cette fois de purifier, de séparer les lipides les uns et les autres.