Examen Bactériologique Des Selles

le, moulée.

4. Examen microscopique

Pour les selles liquides, on travaillera directement sur la selle.

Pour les selles moulées, il faudra faire une suspension à 10 % dans du soluté de NaCI à 9 P. 1000.

▪ Observer les selles à l'état frais (entre lame et lamelle) et noter la présence de :

- leucocytes ;

- hématies ;

- bactéries très mobiles (Vibrio).

▪ Observation des selles après coloration de Gram :

- évaluer le pourcentage de bactéries Gram + et Gram -;

- rechercher les aspects caractéristiques (Campylobacter, Vibrio).

Cet examen est très important et ne doit jamais être omis. Il permet de rechercher les leucocytes qui, en quantité supérieure à 5 par champ, sont le signe d'une diarrhée à germe invasif, de même que la présence d'hématies. Il permet de voir aussi si la flore est équilibrée entre bactéries à Gram positif et à Gram négatif (environ 60 % de bactéries Gram -, et 40 % de bactéries Gram +, dans une selle normale).

5. Ensemencement, identification

Salmonella - Shigella

▪ Milieux d'isolement

Des milieux solides d'isolement pour entérobactéries doivent être ensemencés, soit le milieu Salmonella - Shigella (SS) soit le milieu Hektoen. Le milieu Hektoen est recommandé car il est mieux adapté à la culture des Shigella et plus discriminant. Ces milieux contiennent des inhibiteurs des bactéries à Gram positif et des Proteus. Ils contiennent aussi des sucres et des indicateurs colorés d'acidification, permettant une orientation sur la nature des bactéries en fonction de leurs capacités à métaboliser ces sucres.

▪ Milieux d'enrichissement

En même temps, pour les Salmonelles, un enrichissement doit être effectué dans un milieu liquide contenant des inhibiteurs des autres entérobactéries. Les deux milieux les plus utilisés sont le milieu de Muller Kauffmann qui contient des sels biliaires, du tétrathionate et du vert brillant, ou le milieu de Leifson qui contient du sélénite de sodium. Après 24 heures, le contenu de ce milieu est repiqué sur gélose Hektoen.

L'incubation de tous les milieux se fait à 37° C pendant 18 à 24 heures.

Les milieux Hektoen ou SS doivent ensuite être observés avec attention et les colonies suspectes (tableau n° 1), 5 au moins, doivent être repiquées sur des milieux urée indole.

Une urée positive permet d'éliminer les colonies de Proteus. Les milieux où la réaction urée reste négative doivent être ensemencés sur des galeries d'identification (milieux Kligler, mannitol, citrate, etc. ou galeries API ou autres) (tableaux n° 2, 3 et 4).

Au cas où le diagnostic biochimique conduit à l'identification de Salmonella ou de Shigella, il doit être confirmé par l'identification antigénique.

▪ Identification antigénique

Pour les Salmonella qui comportent plus de 2000 sérotypes, on peut utiliser les sérums OMA et OMB qui sont des mélanges d'agglutinines anti 0 des principaux groupes rencontrés en pathologie humaine. Si le laboratoire en a les moyenne l'identification est poursuivie avec les sérums anti 0 monovalents. Pour cette partie du diagnostic qui demande à être détaillée, nous renvoyons le lecteur aux manuels de microbiologie.

Pour les Shigella, il existe quatre sérums pour l'identification antigénique :

Sous-groupe A (S. dysenteriae)

- sérum A1 anti 1, 3, 4, 5, 6 (indole -)

- sérum A2 anti 2, 7, 8 (indole +)

Sous-groupe B (S. flexneri)

- sérum anti Shigella flexneri 6 sérotypes

Sous-groupe C (S. boydii)

- sérum C1 anti 1, 2, 3, 4 (indole -)

- sérum C2 anti 8, 10, 14 (indole -)

- sérum C3 anti 5, 7, 9, 11, 15 (indole +)

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Sous-groupe D (S. sonnei)

- sérum D

Dans de nombreux pays, les souches de Salmonella et Shigella isolées doivent être adressées à un Centre de Référence, qui collecte les données épidémiologiques (Institut Pasteur).

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Campylobacter jejuni

L'ensemencement se fait sur des milieux contenant des antibiotiques pour inhiber la plupart des bactéries de la flore intestinale. Le plus courant est le milieu de Skirrow contenant Vancomycine, Polymyxine et Triméthoprime.

L'incubation a lieu à 42° C en atmosphère microaérophile (correspondant au mélange oxygène 5 %, gaz carbonique 10 %, azote 85 %). Cette atmosphère peut être obtenue de façon simple avec des sachets à réhydrater extemporanément : Anaerocult C mini, (Merck) ou en jarre anaérobie (Campypack biomérieux, ou Gaspak anaérobie biomérieux sans catalyseur) ou autres réactifs du même type.

L'incubation doit durer 48 heures pour obtenir des colonies visibles. Les colonies sont petites, brunâtres, elles peuvent être muqueuses ou en voile.

C. jejuni est un petit bacille Gram négatif fin, spiralé, très mobile avec des formes en S, en longues spires ou en vol de mouettes. Il est catalase + et oxydase +. Il hydrolyse l'hippurate et est sensible à la céfalotine et l'acide nalidixique. L'identification se fait par les caractères biochimiques (tableau n° 5).

Yersinia enterocolitica

Ces bactéries peuvent être isolées sur milieu Hektoen si on les observe après 48 heures. Les colonies sont petites, de diamètre < 1 mm. Il est mieux d'utiliser un milieu sélectif, le milieu de Schieman, contenant de la Cefsulodine, de la Novobiocine et de l'Irgasan. Après 24 heures d'incubation à 30° C, les colonies sont rouge sombre, d'un diamètre < 2 mm. L'identification biochimique est nécessaire car d'autres bactéries peuvent se développer avec des colonies un peu plus grosses mais d'aspect voisin. Elle peut se faire en galerie Api 20E (tableau n° 6).

Vibrio cholerae

Dans les cas de choléra, l'examen direct montre une flore constituée uniquement de vibrions. Pour la recherche de porteurs sains, l'examen direct n'est pas nécessaire.

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▪ Enrichissement : L'ensemencement se fait à partir des selles : un tube d'eau peptonée alcaline et un tube d'eau peptonée alcaline salée sont utilisés comme milieux d'enrichissement. Il faut ensuite incuber pendant 3 à 6 heures à 37° C, puis prélever une dose de la culture en surface et ensemencer un second tube d'eau peptonée alcaline salée ou non, ainsi qu'un milieu sélectif gélosé TCBS (thiosulfatecitrate-bile-sucrose-agar) et les incuber une nuit à 35° C.

On doit ensemencer également avec les selles un milieu gélosé TCBS et l'incuber une nuit à 35° C.

Sur gélose TCBS, les colonies de Vibrio cholerae sont jaunes, plates, de 2 à 3 mm de diamètre, oxydase positive.

L'identification est faite par les caractères biochimiques (galerie API 20 E ou autre) Tableau n° 7, et par agglutination avec les sérums anti-Vibrio cholerae anti 01 et anti 0139, à partir de colonies repiquées sur gélose nutritive.

Pour la détermination de la sensibilité au composé vibriostatique 0/129, ensemencer un milieu gélosé Mueller-Hinton sur toute la surface de la boîte et déposer un disque de composé. Après 24 heures à 37° C la crois sance de Vibrio cholerae est inhibée (diamètre > 15 mm).

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Escherichia coli

Escherichia coli comme toutes les entérobactéries ne présente pas d'exigences particulières de culture. Il se développe sur les milieux SS et Hektoen. Pour l'isolement à partir d'une selle, des milieux peu inhibiteurs comme la gélose Mac Conkey (biomérieux) ou la gélose Drigalski (Pasteur diagnostics) sont recommandés. L'identification repose sur les tests biochimiques classiques (tableau n° 4).

Une diarrhée à E. coli pathogène sera soupçonnée devant une selle monomorphe ne présentant que des bacilles à Gram négatif à l'examen direct et donnant une culture pure d'E. coli.

Au niveau des selles la différenciation entre E. coli commensaux et pathogènes se fait par la mise en évidence des facteurs de pathogénicité