Cr tp electrophorese

CR TP ELECTROPHORESE

BUT

Le but de ce TP est de vérifier la présence de la protéine d'intérêt dans le blanc d’oeuf, soit le lysozyme, et sa pureté  à l'aide de l' électrophorèse en condition dénaturante suivi d'une coloration Bleu de Coomassie  et de Western Blot suivi d'une coloration Rouge Ponceau.

PRINCIPE

Electrophorèse

Lors de ce TP, nous avons utilisé électrophorèse dans les conditions dénaturantes et réductrices, ou SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate-Poly-Acrylamide Gel Electrophoresis), qui est le système discontinu. Les protéines sont dénaturées par chaleur en présence d'un agent réducteur, le β-mercaptoéthanol, qui réduit les ponts disulfures en modifiant la structure tridimensionnelle native, donc en leur donnant  une forme monomérique,  et d'un détergent anionique fort, le SDS, ou dodécyl sulfate de sodium qui permet de créer une charge négative égale à travers des protéines linéarisées.

Les protéines sont recouvertes de SDS qui forme une couche électronégative. La SDS-PAGE permet la séparation de protéines de même forme et charge  en fonction de leur masse et leur taille. En présence de SDS, les protéines ont une charge négative, elles migrent toutes vers l'anode. Les protéines ayant le petit poids moléculaire sont moins retenues par le gel de polyacrylamide et migrent plus loin que les grosses molécules.

Le maillage, ou le tamis moléculaire, laisse passer  les protéines en fonction de leur taille et de leur forme. La taille des mailles dépend de la concentration en acrylamide (T= (a+b) en g pour 100 mL) et du pourcentage en bisacrylamide ((facteur de pontage en bisacrylamide « cross-linking » 𝐶= [b/(a+b)] ×100 : plus le pourcentage de l'acrylamide est élevé, plus la densité est élevée et plus les mailles sont serrées. Quand la concentration en bisacrylamide est  maintenue constante et la température augmente, la taille des pores diminue. La valeur moyenne des mailles est inversement proportionnelle à √[𝐶]𝑇𝑂𝑇.

La polymérisation est initiée par une réaction radicalaire  grâce au persulfate d’ammonium S2O8ˆ2  et le N, N, N', N'-tétraméthyléthylènediamine (TEMED).

Le TEMED (sous sa forme basique, ce qui implique un pH suffisamment élevé) catalyse la formation de radicaux libres à partir du persulfate.

• [pic 1]

En somme, la polymérisation dépend:

• - La concentration totale en acrylamide et du pourcentage en bisacrylamide ;
• -  La concentration en TEMED et de persulfate (1 à 3 nm) ;
• -  Du pH;
•  - La température à 20 et 30°C

Les protéines sont déposées sur un gel de polyacrylamide coulé entre deux plaques de concentration adaptées à la taille des protéines à séparer :

[pic 2]

Le gel de concentration (stacking gel), c'est un gel de haute porosité qui est situé au dessus du gel de séparation pour permettre une entrée homogène.

Le gel de séparation (de migration) contient des pores plus petits et un pH plus élevé.

Cette technique permet également de déterminer la masse moléculaire approchée de la protéine à l'aide de marqueurs connus. Pour cela il faudra tracer une courbe de calibration ( log(MM)= f (distance de migration)).  

Le pouvoir de résolution est valable dans la partie linéaire.  La protéine ayant une masse moléculaire  trop importante ne rentre pas dans la zone linéaire et donc se trouve en bas du gel de séparation au niveau du front de migration.  

[pic 3]

Mobilité relative = (distance de migration d'une bande)/ (distance de migration du front de migration)

Le bleu de bromophénol est utilisé afin de déterminer le front de migration des protéines et de voir si les protéines ont été mises dans les puits lors des dépôts.

Le glycérol était utilisé comme alourdisseur des molécules pour qu'elles tombent dans les puits du gel.

Electrotransfert

C’est une méthode permettant de transférer les protéines du gel grâce à des interactions hydrophobes et ioniques avec une membrane  afin de pouvoir analyser les protéines en les immobilisant. Cette étape se passe après le SDS PAGE, les protéines sont séparées, alors les bandes de polypeptides sont transférées vers une membrane de nitrocellulose. La membrane est fixée au gel et ce ‘’sandwich’’ maintenu par des éponges et du papier filtre (Whatman) est transféré vers une chambre de l’électrophorèse.  

[pic 4]

La membrane est placée entre le gel et l’anode ce qui permet le transfert des protéines de ces protéines sur la membrane par l’effet d’un courant électrique. En effet, les protéines sont chargées négativement et migrent toutes vers l’anode, et comme la membrane se situe au-dessus du gel celles-ci migreront sur la membrane.

Afin de vérifier si le transfert a eu lieu (la membrane aura absorbé les protéines), on doit observer une coloration du marqueur de masse protéique.

Western Blot (Immunorévélation)

Cette technique permet d’identifier des protéines spécifiques. Ceci va nous permettre  de voir la composition de notre élution dans le TP 1 et conclure quant à la pureté de notre lysozyme.

Elle est constitué de plusieurs étapes :

1. TBS-T: étape de lavage. Le TBS-Tween est un détergent qui dénature les protéines. Durant cette étape, il y a un empêchement de la fixation Aspécifique des anticorps;
2. TBS-Lait 1% (peut se faire avec du BSA ou d’autre protéine): cette étape  permet de saturer la solution en protéines et éviter que les anticorps se fixent sur la membrane (sans protéines);
3. Ajout des anticorps spécifiques propres à une protéine;
4. Résorption des fixations aspécifiques par le TBS-Tween. Grâce à ce lavage les anticorps sont enlevés.
5. Révélation par la coloration au Rouge Ponceau .

Coloration au Rouge Ponceau

C'est une coloration non spécifique des protéines, peu sensibles. La décoloration se réalise avec de l'eau.

Coloration au Bleu de Coomassie

Après électrophorèse, les protéines sont révélées par la coloration Bleu de Coomassie. C'est une coloration non spécifique, assez sensible.  Cette technique permet de visualiser toutes les protéines d’un échantillon donné. La décoloration se fait à l'aide de l'acide acétique à 10% et du méthanol.

ANALYSES et RÉSULTATS

1. Préparation des échantillons

On a préparé 6 tubes: T1, T2, T3, F1, F2 et E1.

T1 contient les marqueurs de masse moléculaire, c’est-à-dire il contient un mélange de protéines de masses moléculaires connues :

• Phosphorylase B (376 kDa);
• Sérum albumine bovine (67 kDa);
• Ovalbumine (43 kDa);
• Anhydrase  carbonique (30 kDa);
• Inhibiteur de la Trypsine (20,1 kDa);
• α-lactalbumine (14,4 kDa). 

T2 représente le mélange des Immunoglobulines G et de la solution 2 qui contient du β-mercaptoéthanol 2%. Ce qui signifie que les protéines qu’on y retrouve sont dénaturées.