Les outils du génie génétique

Génie génétique

Les outils du génie génétique :

Acides nucléique= matériel de départ

Extraction/ purification part de cellule ; cellule bactérienne ou eucaryotes ou autre ; elles sont lysés cest la partie générale par l’action d’un détergent ou par la solution par ultrason ect par différentes méthodes mécaniques ou chimiques ; On va ensuite dissocier les protéines et les dénaturer (protéine lié à l’ADN) ca se fait par action d’une protéase = dégradation d’une protéine ou un agent chaotropique un agent qui va détruire liaison faible qui unisse les a nucléique et les protéines ; elles vont être éliminé par extraction avec 2 solvants non miscibles entre eux (phénol et chloroforme) et le phénol va être à PH légèrement alcalin (7 et 8 ) cette extraction va donner 2 phases = dans la phase inférieur phase organique on va retrouver molécule lipophile (lipide)et ARN (due Ph alcalin) et protéine hydrophobe ; la plupart des protéines qui sont soit pas du tout hydrophobe ou moyennement se trouvent dans l’interphase(disque assez solide, un peu visqueuse blanchâtre) dans la phase supérieure la phase aqueuse= ADN ; on va récupérer cette phase supérieur et on va faire une précipitation de l’adn par l’éthanol ou par l isopropanol en présence dun alcool en présence de sel cest une méthode classique de purification de la molécule d’ADN ; donc suite à cette précipitation de l’adn à l’alcool on va faire des lavages différents avec de l’éthanol à 70% des séchages et finalement diluer dans l‘eau ; les lavages ont pour objectif de (on va avoir un culot) et ce culot blanc en fait il est blanc parce quil est très riche en sel et donc les lavages avec l’éthanol à 70% ont pour objectif de retirer cette forte concentration en sel car le sel a une meilleure solubilité dans l’alcool à 70 % qu’a l’alcool pure.on aura un culot qui restera translucide et qui sera plus tout blanc ; ensuite après dissolution dans l’eau on peut conserver notre ADN pendant un certain temps notamment congelé.

On peut affiner la méthode avec une élimination des ARN qui pourrait contaminer nos échantillons malgré l’extraction en faisant agir une enzyme spécifique (RNAse) qui détruit les ARN sans détruire les ADN ; cette méthode d’extraction elle est la métgode historique utilisé très fréquememen encore mais lorsque lon a bcp d échantullon a utiliser on peut utiliser des méthodes plus rapides qui utilise des matrice de chromatographie donc ici le protocole est présenté sur la  diapo (tout commence par dissociation les tissus ou lyser les cellules ; la lyse des cellules ensuite on met tout le lysat de cellule dans le haut du receptacle du ppot et on va centrifuger et la membrane va retenir les acides nucléiques et laisser passer les débris cellulaire tout ce qui interesse pas on va idéalement faire des lavages oour s’assurer que les débrus soit bien élimné pour garder que l’ ADN puis on a une étape d élution (entre chaque on a une centrifugation très breve mais à grande vitesse) et on va ensuite ajouter une solution qui va permettre l elution et récupérer adn purifier dans la partie du bas ;

Souvent on va utiliser des plasmides  des adn circulaires souvent d assez peites taille et il est donc nécessaire de pouvoir extraire ces adn plasmidique spécifiquement sans avoir d adn génomique pour cela on va faire comme dhabitude ; cad on est avec des bactéries après notre culture de bactérie on peut obtenir un culot de bactérie et on va lyser ces cellules et pour cette lyse on va utiliser des produits assez drastique donc on va utiliser une lyse alcaline qui permet de dénaturer l adn cette lyse commence par l action dune enzyme le lyzozyme qui est capable de dégrader la paroibactérienne surtout lorsquelle est en présende  d edta ; on va ajouter la solution alcaline (cest e la soude aditionné du détergent le plus fort le sds) rien ne pourra résister à cette addition et comme on est dans un milieu très dénaturant on a plus une suerle macromolécule qui nest pas impacté tout se retrouve totalement dénatur »é pro adn arn ; on va neutralsier ce milieu très alcalin et on vapermettre la renaturalisation de l adn mais uniquement adn plasmidique on va ajouter une soilution d acététe de potassium de 3 molaire et de ph 4,8 pour neutralsier la soude et renaturer l adn plasmidique uniquement ; cette denaturation de l adn elle est totale et la renaturer elle va être différente selon la taille de la molécule et la conformation de la molécule, l adn genomique des bactéries même si il ets plus petit que l adn genonmqiue que l adn des cellules humaine il ets bcp plus grand que l adn des plsmides donc cets oour ca qu’on arrive à renaturer spécifiqueent les plasmides surtout qd ils sont petits sans renaturer les autres adn et donc cette méthode nous permet de récupérer spécifiquement l adn plasmque ;

La suite ressemble a ce uon a déjà vu on faire une extraction on recupere la phase aqueuese on précipite dans l alcool et on va faire des lavages pour éliminer les sels et on peut faire agir une rnase pour éliminer ARN et on va récupérer nos plasmides et in va pouvoir utiliser par la suite.

On va extraire des arn et plus des adn ; le principe general est le même mais avec quelques petites différneces ; une des méhodes extrêment utilisé est la métjode d’extraction au thiocynate de guanidium rôle dagent chaotropique donc on a un mélande de phénol saturé en eau et ph acide (4) spécifique pour extraire les arn et un agent chaotropique le TG  qui va permettre de dénaturer les protéine et les arnase et séparer aussi les arn ribosomique des protéines ribosomiques le chlorofprme est ajouté et le mélange ets centrifugé souvent on a une solution commercial qui continne à la fois ele phénol et l agent et le chloroforme et un agent stabiliosateur et colorant donc on a tjrs notre phase aqueuse en eau et phase organique en bas , qui cette fois à en plus des particule slipidiques, les protéines hydrophobe va contenir  adn l interphase continetn tjrsd pro amphiphile ou hydrophile et la phase aqueuse va contenir spécifiquement les arn on va récupérer cette phase aqueuezse et la precipiter avec isopropanol pour obtenir le culot d arn qui va ertre de la même façon que tout a l heure lavé ect pour se débarrasser des sels ; on a de la même façon que l adn la possibilité d uitliser méthodes plus rapides par centrifugation avec le même principe on élimine ce qui nous interesse pas et elution pour récupérer arn pour utiliser dans différentes méthodes

De façon à déterminer la pureté de nos acideq nucléiques et de pouvoir déterminer la quantité dont on dispose on va faire une méthode classique de spectrophotométrie on a la bande d absorption de l adn et protéine (SAB) et on voit quil y a une absorption max vers 260  de l adn et les protéines avec leurs résidus acide aa aromatique (tryptophane phénilalanine tyrosine) absorbent à 280 ; on fait double mesure à 260 (donne quantité adn) et à 280 = indicateur de la présence ou non de protéine) pour adn double brin classique aps trop grand on a une relation qui nous permet de dire qu’une unité de do = 50 microgramme/ML d adn ; si on mesure la DO à 280 et que cette DO est inférieure à 1,8 = présence de protéines ; si rapport est supérieure à,2 cest indicateur de présence ARN ou éthanol, donc idéalement ce ratio de Do à 260 sur la DO à 280 doit être compris entre 1,8 et 2 ce qui indique une bonne qualité de notre extraction d adn ; si à l’inverse on s interesse à arn cette fois ci on va faire la même chose cette fois ci une unité de do = 40 microgramme */ml et on a le même test de qualité  et peut être plus proche de 2 car on cherche à obtenir des ARN ;

On peut avoir un autre test de qualité Ado260/ DO 230= présence de phénol urée EDTA

Mesure DO 320 nm indicateur de la présence de particule/ d’impureté

Analyse de l’ADN par électrophorèse

Voir schéma sur poly

Tampon de migration = électrolyte ; Adn additionné d’un marqueur fluorescent ; colorant pour voir dépôt dans le gel et on a ajouter un colorant qui va s’intercaler entre les bases de l’ADN et qui va permettre d’obtenir les images sur la table à UV .

On a des profils de migration d’ADN génomique lorsqu’il est intact se présente sous la forme d’une bande de très haut poids moléculaire, lorsqu’io y a dégradation on a une bande sans bande de haut poids moléculaire on a un « smir » une trainée blanchâtre correspond à des fragments de toutes les tailles possibles, et si il est digéré par des enzymes de restrictions on peut avoir des fragments un peu plus net qui apparaissent à différentes poids moléculaires ; un ADN plasmidique lorsqu’il va donner un profil d électrophorèse différent on a pas de grande taille on a des taille plus petites. Si on coupe le plasmide une fois on va une seule bande qui correspond à un ADN linéaire et si on le coupe ^pas on va avoir un minimum de deux bandes qui correspond à ADN relâché ou un ADN circulaire super enroulé on peut parfois avoir une 3 bande qui correspond à un autre état d ADN super enroulé ; classiquement on ajoute des marqueurs de poids moléculaires qui sont des espèces d’échelle qui permettent de dire que ces fragments ont telle ou telle taille.

Pour les ARN on a un profil de migration qui lorsque l’ ADN  dégradé donne pareil une grande trainée blanche avec poids moléculaire très petit et lorsqu’il est pas dégradé on a deux bandes principales qui sont visibles qui correspondent aux ARN  ribosomiques.

Les enzymes de restriction et autres enzymes

Voir poly

Différents types d’enzymes de restriction

Pb=pair

Dans tableau on a quelques noms plus fréquents les premières lettres corrsmond aux nom de genre et espces ; un numéro qui permet de les distinguer en chiffre romain ; on a enzyme qui reconnaisse des sites de restrictions qui peuvent afvoir différentes tailles  à 6 nucléotides par exemple ou 4 ect… ou sites de reconnaissance plus grand genre 8 nucléotides ; plus il ets petit plus ce site va être fréquent dans un adn donnée ; les plus utilisé 4 ey 6