Résultats tp trypsine

Résultats :

Dilution du substrat Z-Arg-p-NA 200mM

Pour réaliser le dosage spectrophotométrique, on réalise une dilution du substrat afin d’obtenir une solution de plus faible concentration.

CiVi=CfVf

On a Ci=200mM Cf= 2mM Vf= 50mL

D’où Vi= CfVf/Ci= (2.10-3x50.10-3)/(200.10-3)=5,0.10-4L= 0.50 mL

Donc pour réaliser la solution fille, nous prélevons un Vi= 0.50 mL

Calcul du coefficient d’extinction molaire

d’après la loi de Beer-Lambert :

A=E.l.c

E=A/(l.c) = 0.868/(1x98.10-6)= 8857 L.mol-1.cm-1

Programe trypsine A (annexe 1 )

Exemple de calcul de vitesse à t=1min

Vitesse (nmol/min) = (V(DA/min)xVtot)/(E410 nm) avec Vtot = V sub+Vtampon+ V enz=

= 0,02+1,98+0,025 = 2,025 mL

= 2,025.10-3 L

= (0.0237x2,025.10^6)/(8857)= 5.41 nmol.min-1  nous on a 0,0237 pour le temps à 2 min alors que eux ils ont des valeurs plus élevées..où est ce que ça change ? dans les doses ? moi j’ai rien vu) Chaque poste a des valeurs différentes du coup on peut les garder. Noiriel nous avait dit c'est bien

Csub = (CixVsub)/Vf = (2.10-3)x(0.020.10-3)/(2,025.10-3)= 1,98.10-5 mol.L-1

Analyse de la courbe du tableau 1 (annexe 1 )

tableau à placer sur papier millimétré si possible fait

la courbe est decroissante. La plus forte valeur est 5,67 nmol/min . Cela est dû à la disponibilité maximale du substrat pour l'enzyme. Entre 0 et min, la courbe diinue fortement. A partir de _7 min, la vitesse diminue plus lentement car la dispo du substart pour l enzyme est beaucoup plus faible à cause de la transformation du substrat en produit. Enfin, à 10min, la valeur de la vitesse est tres faible car la majorité du substrat a été transformé en produit.

Etude de l’influence de la concentration d’enzyme

Sachant que la concentration massique de la trypsine est égale à 1mg/ml= 1g.L-1 et M(trypsine) = 23400 Da = 23400 g.mol-1

Alors la concentration molaire de la trypsine est égale à (trypsine]massique/Mtrypsine=1/23400=4,274.10-5 = 42,74 micromol.L-1

Exemple pour le tube 1 :

Vf = 2 + 30.10-3 + 20.10-3 = 2,05.10-3 L dans chaque tube et V enz = 20.10-6 L

C enz = (CixVenz)/Vf = (42,74x20.10-6) / (2,05.10-3) = 0,417 micromol.L-1

V(nmol/min) = V(Da/min)xvf / E = 0.4847 x 2,05.10^6 / 8857 = 112,19 nmol/min

Analyse de la courbe 2 (annexe 2 )

tableau à placer sur papier millimétré si possible fait

on constate que l'on obtient une droite croissante qui montre que la vitesse est proportionnelle à la concentration en enzyme . D'apres l equation de michaelis menten :

vi = (Vm+[S])/(Km+[S])

donc vi= (kcat*[Etotal]*[s])/(Km+[s])

alors la vitesse et la concentration en enzyme sont bien proportionnels quand la concentration du substrat est fixe. Ainsi, plus la concentration en enzyme augmente, plus la vitesse croît. En effet, la vitesse augmente de 0 à 662,8 nmol/min

Etude de l’influence de la concentration en substrat

COLLER TABLEAU A LA FIN DU FASCICULE

Dans cette expérience, Vf = 2 + 40.10-3 = 2,04.10-3 L

Exemple du calcul de V(nmol/min) pour [substrat] = 0,148

V(nmol.min-1) = (V(DA/min)x Vf) / E = 0,2618 x 2,04.10^6) / 8857 = 60.30 nmol.min-1

etude de la représentation de Lineweaver Burk

Equation de michaelis et Menten : Vi = (Vm.S)/(Km+S)

1/Vi= (Km+S)/Vm+S = Km / (Vm.S) + S/Vm.S

1/Vi = Km/Vm x /S + /Vm

On a une equation de type y=ax+b

pour x=0 on a A(o;3*10^-3)