TP Transdisciplinaire

Ourrisse Wafaa

Péanne Romane

Semaine du 25 au 29 Novembre

Projet Transdisciplinaire

Compte Rendu travaux pratique

Introduction

(Gants pour éviter la contamination)

Partie 1 : LUNDI 25 NOVEMBRE

Dans cette première partie il s'agit de vérifier si la chitine est un bon éliciteur, un éliciteur est une molécule produite par un agent phytopathogène ou un ravageur, qui induit chez une plante la production de phytoalexines, c’est une hormone qui va déclencher les mécanismes de défense chez la plante avec production de défensives. Nous allons essayer de démontrer par RT-PCR que la chitinhepatose stimule les mécanismes de défense chez la plantule de riz notamment l’expression du gène de défense WRKY 53. Il n’est pas nécessaire de purifier les ARNm pour la faire la RT-PCR car on utilisera des amorces spécifiques du fragment qu’on souhaite amplifier, et ce sera le seul visible lors de la migration sur gel d’agarose.On utilise un gel d’agarose (à 1,2%) pour réaliser l’électrophorèse appliquée aux acides nucléiques.

I ELICITATION DES PLANTULES DE RIZ ET EXTRACTION DES ARN

A) Traitement du riz par un éliciteur

Dans cette première expérience nous allons déposer des feuilles de plantules de riz que nous avons découpées au préalable dans deux boites de pétries distinctes.

• Une boite E1 à laquelle nous avons ajouté de la chitinhepatose (10g/L)*
• Une boite C1 qui ne contient que de l’eau

*:

Les boites sont incubées à température ambiante pendant une heure, pendant ce temps nous broyé une plantule directement sortie de la Terre nommé NT, ce broyat nous permettra de déterminer si la plantule n’avait pas été infectée avant la chitinhepatose ou un autre agent.  

B) Broyage des échantillons

Une fois nos boites de pétries incubées, nous avons broyé les feuilles à l’aide d’un tampon d’extraction (PFR + PFL) et d’un peu de sable.

Nous avons trois broyats différents que nous avons transférés dans des tubes : NT, E1 et C1

C) Extraction des ARN

Cette Manipulation nécessite des gants obligatoirement pour ne pas contaminer les échantillons

Afin d’extraire les ARN présents dans nos broyats nous allons utiliser un kit d’extraction : Nucleospin RNA Plant sui s’applique en 5 étapes :

• 1) Clarification des extraits bruts
• 2) Ajustement des conditions de fixations des ARN à la colonne
• 3) Fixation des ARN sur la colonne
• 4) Lavage de la membrane
• 5) Elution des ARN

Voici un schéma récapitulatif de notre manipulation.

[pic 1][pic 2][pic 3][pic 4]

[pic 5]

Les ARN sont fixés sur les membranes des colonnes bleues grâce à l'éthanol, puis asséché par les centrifugations, c’est la RNAse free qui les fait descendre des colonnes bleues sans les dégrader.

D) Dosage des ARN

On réalise une dilution au 1/20ème pour doser nos ARN dans nos tubes, nous voulons un volume final de 250 micros-litres, avec un produit en croix on déterminer nos volumes à prélever. On prendra 237,5 micro litre d’eau distillée et 12,5 micros–litre d’ARN

Pour doser l’ARN présent dans nos tubes on les soumet à un spectrophotomètre respectivement à 260 et 280nm

On mesure l’absorbance à 260nm pour les acides nucléiques ce sont les bases qui absorbent avec leur cycle aromatique, les acide aminé Tryptophane absorbe à 280nm on mesure donc également l’absorbance à cette longueur pour voir si on a une contamination par des protéines.

Une absorbance égale à 1 correspond à une concentration en ARN de 40µg/ml, le ratio A260/A280 doit donc être compris entre 1,7 et 1,9.

Calculs de concentration des ARN dans nos extraits

D’après nos données, on sait que pour 1micro-gramme on a 40micros-gramme /mL  d’ARN donc :

• Pour NT : 0,071 x 40 / 1 = 2,84 que l’on multiplie par 20 car on fait une dilution au 20ème = 56,8 micros-gramme/mL
• Pour C1 : 17,6 micros-gramme par millilitre
• Pour E1 : 94,4 micros-gramme par millilitre

Les ratios pour NT et C1 sont bons, cependant E1 est en dehors de l’intervalle, il est possible qu’il y ait eu une contamination des ARN par des protéines. On remarque une une plus forte concentration d’ARN pour l’échantillon E1 qui contient la chitinhepatose, cette différence mesurée au spectrophotomètre ne peut pas être considérée comme significative donc on ne peut pas encore déterminer si c’est l’élicitation qui a induit cette augmentation de production d’ARN dans l’échantillon.

Nous avons calculé les concentrations de chacun de nos ARN afin de mettre la même quantité pour chaque lors de la PCR. En effet cette étape de PCR va nous permettre de comparer la quantité d’ADNc de l’actine et la quantité d’ADNc de WRKY53 par rapport à la quantité totale d’ADNc.

B) RTPCR

Dans cette partie on souhaite étudier l’activité de l’expression de 2 gènes; celui qui code l’actine et celui qui code le FdT WRKY53  en réponse au traitement par la chitinhépatose.

On commence par faire une RT sur nos 3 échantillons d’ARN pour obtenir des ADNc. Puis sur chacun de nos échantillons on fait une PCR qui amplifiera l’ADNc de l’actine et une PCR qui amplifiera l’ADNc de WRKY53. On utilise le gène de l’actine car celui est un gène de ménage présent de manière identique dans toutes les cellules de l’organisme. Enfin on analyse les résultats par éléctrophorèse sur gel d’agarose.  

II Transcription inverse pour l’obtention des ADNc

A) Hybridation des ARN avec l’oligodT 

Le Vf souhaité est de 10µL or, avec les concentrations de nos produits il nous impossible d’atteindre ce volume sans déborder et de ce fait nous avons fait le choix de ne mettre que 8µL d’ARN NT+2µL d’oligo dT dans le tube 1 ;8µL d’ARN C1 + 2µL d’oligo dT dans le tube 2 et 6µL d’ARN E1+ 2µL d’oligodT et 2µL d’H2O Rtase

On prépare en parallèle un “mix” que l’on compose de la façon suivante :

On prélève 10µL de ce “mix” que l’on met dans chacun de nos échantillons. Ces derniers sont mis a incuber a 25° puis a 45°

B) PCR:

On réalise ensuite une PCR pour amplifier nos 2 gènes d’intérêts.