Tp Biotechnologie

e Pnos  Promoteur de la nopaline synthase RB  Bordure droite

Le terminateur 3’RbcS (rubisco)

L’agro infection :

 Première étape  Peut être effectué de différentes façons :     Electroporation Choc thermique (avec traitement chimique au préalable) Transformation bactérienne (chimique ou physique) Conjugaison triparentale

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Conjugaison triparentale

ADN-T pKY70GIN Bomb Tra pRK Mob

E. coli : Vecteur ne possède pas les éléments nécessaires à la conjugaison  Bomb : séquence qui permet de signaler à la souche donneuse qu’elle prête à transférer.  Resistance à la kana Pmp90

Souche helper : contient deux séquences utiles : Tra=pour le transfert Mob=pour la mobilité  gènes de résistance à la kana

A.tumefaciens Résistante à la gentamicine

Une double sélection Genta /kana va permettre de sélection l’agrobacterium ayant intégré le plasmide d’intérêt. fin de savoir si l’on a le plasmide qui intéresse dans l’agrobacterie,on fait une PCR avec des amorces spécifique à l’ADN-T. Manipulation : 9 boites ont été préparées:1boite LB ; 2 boites LB-G ;6 boites LB-GK Sur la boite 1 contenant le LB, les différentes souches ont été déposées selon le schéma suivant : La boite sera ensuite mise à 28°C pendant 48h

T+

R+H

R+D+H

R+D

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Co culture.

Pourquoi fondre l’embout entre nœud : Pour optimiser la zone de contact entre agro bactérie et le plante et donc améliorer l’infection. A cote de l’agrobacterie, il y a la biolistique (Bombardement de particules d’or recouvert d’ADN sur les cellules végétales ou tissus végétales. On a aussi la transformation des protoplastes  Choc électrique/Electroporation (méthode physique)  Traitement au polyéthylène glycol (méthode chimique) Jour 2

Conjugaison triparentale (suite)

Récupération d’agrobacteries incubées la nuit et étaler des dilutions sur le milieu sélectif

L’agro infection (suite)

Elimination des agro bactéries des tiges infectés afin d’obtenir des cals transformés exempts de toute contamination. Test GUS  Permet la visualisation rapide et simple de l’expression GUS

Β-Gluc

X-GLuc

X +Gluc

En condition oxydative

X2 (coloration bleu)

Préparation de la solution GUS  TP phosphate à ph7 : pour avoir un pouvoir tampon  EDTA : agent chélateur d’ions métalliques divalents (Mg++), le B-glu est inhibé par les ions divalents.  K+Ferri et K+ Ferro : optimise la dimérisation  Triton : détergent (doux) non ioniques différents du SDS qui est ioniques. Elle participe a la permeabilisation des cellules  X-Glu : substrat

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La lacération des feuilles permet l’entrer de la substance dans la plante.

Partie animale

Production de protéines recombinantes chez les bactéries, l’intérêt est de disposer des quantités importantes pour ensuite être analysé. La protéine utilisé va être exprimé sou forme de fusion.

GST

P53

La protéine P53     Enzyme clef du cycle cellulaire Est un signal si la cellule va subir la phase S ou pas Cible de choix d’agent pathogène qui provoque des tumeurs 50% de cancer sont due à des défauts de la P53

Pourquoi faire une fusion  Facilité les expérimentations que l’on va effectuer  Avec la fusion à la GST, on n’est pas à abri qu’elle altère la structure de la protéine Solution à la GST  L’utilisation des tags (ajout d’une séquence peptidique : constitue un épitope)  Avec les tags, la protéine d’intérêt est facilement repérable  Le plus connu des tags est le 6His (son intérêt : chromato affinité sur une résine d’ions divalents)  Les tags permettent une purification simple de la protéine  Il existe un autre tag, le tagHA : 7 acides aminés de la protéine de hémagglutinine Les élément du TP  Bactéries dédié à l’expression de la protéine  Souche BL21  Caractéristiques de base :(protéase -)  il existe aussi une souche appelé Rosetta (mieux pour les protéines eucaryotes) : déchiffre le code génétique.  Il y a aussi la souche origami : c’est une souche optimisé pour le repliement des protéines eucaryotes

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Vecteur d’expression Caractéristiques du vecteur  MSC : clonage du cDNA  Promoteur tac : dérivé du promoteur lac, inductible par le lactose (qui n’entre pas dans la cellule).on utilise donc un analogue artificiel : L’IPTG (permet de pallier les problème de toxicité)

IPTG Promoteur tac P53

MSC

PGEx-5X-1

AmpR  Promoteur inductible (au cas la protéine sera toxique)  AmpR : gène de résistance à l’ampicilline  Site de clivage : facteur10 = facteur de coagulation du sang (protéase), elle reconnait e site GST et le libère la protéine d’intérêt. Chercher les meilleurs paramètres pour avoir induction maximal 1. 2. 3. 4. 5. Temps d’incubation 30’ à 4h (max) Intensité de l’induction : concentration différentes en IPTG (2 concentration à tester) Température d’induction 37° ---- 20° Différente souche bactérienne : BL21, Rosetta Améliorer le milieu de culture : LB, TB, 2YT

Le glucose utilisé ici à pour rôle de réprimer complètement le promoteur tac afin qu’il ne s’exprime pas. Jour 3 : induction de l’expression Elément de TP  Tris-Hcl  Beta mercaptoethanol : c’est un agent réducteur  SDS : agent dénaturant des protéines

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Biotechnologies animales et végétale SLO6-BC01  Glycérol : permettre de densifié l’échantillon Le blanc utilisé pour la DO est PBS Purification : chromatographie d’affinité TUBE 6

GST

P53

+

Substrat de la GST : glutathion

Incubation

GST

P53

Lavage et centrifugation

TUBE 7

Elution : décrocher la protéine de la résine

+