Tp Immunoglobuline G

de déterminer les masses moléculaires grâce à une électrophorèse SDS PAGE réalisée en condition dénaturante ou non.

II. MATÉRIEL ET MÉTHODES

Avant toute description du protocole, il est important de souligner que les échantillons sont conservés dans la glace afin d’éviter toute dégradation par des protéases. Les tampons 1 et 2 qui seront décrits sont composés de Tris-HCl 20mM, pH 8,0, NaCl 30mM pour le premier et de Tris-HCl 20 mL, pH 8,0, NaCl 0,75 M pour le second.

1. Fractionnement du sérum par précipitation au sulfate d’ammonium

Les IgG d’agneau contenues dans 3 mL de sérum précipitent à une concentration de 1,4 M de sulfate d’ammonium.

Un échantillon de 100 µL de sérum (Fraction F0) est préalablement conservé avant la précipitation.

Trois tubes Eppendorf contenant chacun 1 mL de sérum sont préparés avant d’y ajouter lentement le sulfate d’ammonium (1,4 M). Après incubation des trois suspensions d’IgG précipitées dans la glace pendant 1 heure et durant laquelle elles sont manuellement et délicatement agitées à plusieurs reprises, les trois préparations sont centrifugées à 7000 rpm pendant 15 minutes à 4°C.

Les surnageants sont éliminés, les 3 culots sont séchés avant d’être remis en suspension dans 0,5 mL de Tampon 1. La fraction F1 est ainsi préparée.

2. Dessalage par filtration sur Sephadex G25

La colonne PD10 (fournit par la professeur) est équilibrée avec 30 mL de tampon 1 (1X). Une fois que le tampon pénétre dans le gel, 0,5 mL de F1 sont déposés sur le gel et entrent dans la colonne. La solution de tampon 1 est de nouveau déposée sur le gel afin de récupérer à la sortie de la colonne, différentes fractions de 1 mL.

L’absorbance des fractions obtenues est mesurée à 280nm dans une cuve à Quartz à l’aide d’un spectrophotomètre.

Les 4 fractions ayant les Densités Optiques (DO) les plus élevées sont mélangées et 200 µL et sont prélevés puis conservés. Cela constitue ainsi la fraction F2.

3. Chromatographie d’échange d’anions sur DEAE

a) Préparation de la colonne

Du tampon est versé jusqu’au sommet de la colonne afin de dégazer le robinet tout en conservant la moitié du tampon dans la colonne auquel sera ajouté la suspension de DEAE.

La résine est tassée puis équilibré à l’aide du même tampon qu’utilisé précédemment.

b) Chromatographie

F2 (3,8 mL) est déposée au sommet de la colonne et pénètre dans la résine. Puis 14 mL de tampon 1 sont ajoutés dans le but de collecter l’effluant à la sortie de la colonne par différentes fractions de 2 mL. Ces dernières sont mesurées au spectrophotomètre, dans les mêmes conditions que celles décrites dans la manipulation précédente afin de déterminer pour chacune d’elles, leur absorbance. Les fractions présentant une DO significativement supérieure à 0 sont mélangées et conservées. De cet échantillon, 200 µL sont mis de côté constituant la fraction F3.

Sur cette même résine sont versés 14 mL de tampon 2 et comme ci-dessus, les éluats sont collectés puis les absorbances sont évaluées dans les mêmes conditions de mesure. Les échantillons ayant les DO les plus élevées sont mélangées et 200 µL en sont prélevés. La fraction F4 est ainsi obtenue.

4. Dosage des protéines par la méthode de Bradford

Une solution mère de BSA (0,2 mg/mL) est préparée afin de réaliser une gamme étalon de 6 échantillons concentrés de 0 à 100 mg/mL en protéine. La méthode de Bradford repose sur le changement d’absorbance qui se manifeste par le changement de couleur du bleu de Coomassie après complexation des acides aminés aromatiques et des résidus hydrophobe présents dans la BSA. L’absorbance de ces 6 essais est mesurée à 595nm au spectrophotomètre permettant d’établir une courbe d’étalonnage servant à déterminer les concentrations protéiques des fractions obtenues précédemment.

Les fractions conservées auparavant doivent être diluées pour que leur mesure soit rendue possible. F0 est diluée au 1/50ème tandis que F2, F3 et F4 le sont au 1/10ème. Puis 3 échantillons contenant 10, 20 et 40 mg/mL des fractions F0 et F2 sont préparés avant que les DO soient mesurées. Concernant F3 et F4, 2 échantillons protéiques de 20 et 40 mg/mL sont réalisés pour être mesurés à 595 nm.

5. Analyse de la pureté des fractions par électrophorèse SDS PAGE et détermination des masses moléculaires

a) SDS PAGE en condition dénaturante

Un gel de polyacrylamide est préparé à partir d’un gel de séparation à 12 % et d’un gel de concentration à 4 %. Une fois le gel polymérisé, il est monté dans une cuve à électrophorèse en présence de tampon de migration Tris-Glycine 1X, SDS 0,1 %.

Parallèlement, 20 µg de F0, 15 µg de F2 et 4 µg de F3 et F4 sont respectivement préparer et mélanger au tampon de charge 5X et avec β-mercaptoéthanol. Les échantillons sont centrifugés quelques secondes et chauffés 5 minutes à 100°C au bloc chauffant. Les fractions sont placées immédiatement dans la glace avant d’être déposées sur le gel de polyacrylamide à raison de 20 µL par puits pour chaque fraction, ainsi que 5 µL de marqueur de taille.

La migration est réalisée à 120 V jusqu’au gel de concentration puis à 180 V jusqu’à la sortie du front de migration.

Le gel est ensuite coloré sous agitation pendant 1 heure dans une solution de bleu de Coomassie avant d’être décoloré à l’aide d’une solution décolorante pendant toute une nuit.

b) SDS PAGE en condition non dénaturante.

Un gel de polyacrylamide est préparé à partir d’un gel de séparation à 8 % et d’un gel de concentration à 4 %. Celui-ci est placé dans une cuve à électrophorèse en présence de tampon de migration identique au précédent.

Un échantillon contenant 4 µg de F4 est préparé par ajout de tampon de charge 5X dépourvu de β-mercaptoéthanol en quantité suffisante pour 20 µL.

L’échantillon est déposé dans un puits du gel et la migration est réalisée dans les mêmes conditions que précédemment. Le gel est coloré puis décoloré avant d’être photographié.

III. RÉSULTATS ET DISCUSSIONS

1) Obtention de F1 et de F2

F1 est obtenue après ajout de sulfate d'ammonium au sérum (F0), incubation, centrifugation puis récupération des culots dans du tampon 1.

Le dessalage de F1 est effectué de la manière suivante :

Figure 1 : schéma de la technique de dessalage par gel filtration sur Sephadex G25

Il permet d'obtenir F2.

2) Obtention de F3 et de F4

F3 et F4 sont ensuite obtenus par chromatographie d'échange d'anions sur DEAE.

Figure 2 : schéma d'une chromatographie d'échange d'anions sur DEAE.

Les courbe d'élution de la DEAE : DO280nm = f(volume élution) sont donnée ci-après (graphiques 1 et 2). Cela permet de distinguer nettement les fractions F3 et F4 par changement de force ionique.

Graphique 1 : Mesure de l'absorbance à 280nm des différentes fractions protéiques pour le tampon 1

Ces résultats montrent qu’il faut prendre les quatre premiers échantillons pour constituer la fraction F3.

Graphique 2 : Mesure de l'absorbance à 280nm des différentes fractions protéiques pour le tampon 2

Ces résultats montrent qu’il faut prendre les échantillons 3 à 8 pour constituer la fraction F4.

3) Dosage des protéines par la méthode de Bradford

Les résultats des différents volumes, concentrations, teneurs en protéines, facteurs de dilution sont présentés dans le tableau 1.

Méthode de calcul des quantités de protéine à déposer d’après l’exemple de la fraction FO :

Il y a 18,1µg de protéine dans 20µL. Cela revient à une concentration massique de 0,905µg/µL. Or, l’échantillon a été dilué au 50ième, puis on le redilue 20 fois pour que la concentration soit comprise dans la gamme étalon de la BSA. La concentration est donc de 2,26µg/µL. 20µg de F0 sont à déposer et le volume à prélever est obtenu par un produit en croix :

(20x1) : 2,26 = 8,84µL

Le volume d’eau s’obtient en soustrayant le volume à prélever ainsi trouvé, aux 20µL à déposer dans les puits.

Ici, il faut ajouter 11,16µL d’eau.