Protocole

e culture de départE.Coli. Mettre en suspension ces bactéries dans du tube +pGLO en agitant l’anse immergée dans la solution de transformation jusqu’à dispersion des bactéries … Replacer le tube dans la glace et renouveler l’opération pour le tube -pGLO. 5. A l’aide d’une micro-pipette, prélever 10 µL de solution d’ADN plasmidique (tube pGLO) et mélanger à la suspension bactérienne du tuge +pGLO. Faut-il renouveler l’opération sur le tube -pGLO ?

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Les facteurs d’optimisation de la transformation (pénétration du plasmide dans la cellule bactérienne) choisis résultent de recherches empiriques (1970) : Les ions Ca++ apportés par la solution de transformation CaCl2 neutralisent les charges négatives répulsives de la membrane bactérienne et de la molécule d’ADN plasmidique, favorisant ainsi son adhésion. L’incubation initiale dans la glace stabilise les mouvements moléculaires dans la membrane bactérienne Le choc thermique (passage de 0°C à 42°C) accroît la perméabilité de la membrane bactérienne. Ces 2 étapes favorisent la pénétration du plasmide dans la cellule. Une incubation finale dans du bouillon de culture permet un début d’expression du gène de résistance à l’antibiotique.

Lycée J.Moulin Pézenas – janvier 2003 Atelier scientifique OGM

D’après Biotechnology explorer – pGLO bacterial transformation kit

6. Incuber les tubes 10 minutes dans la glace.

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7. Choc thermique. Transférer rapidement les tubes +pGLO et -pGLO de la glace vers le bain marie 42 °C, exactement 50 secondes. Replacer rapidement les tubes dans la glace. Incuber les tubes 2 minutes dans la glace.

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Vérification des résultats de la transformation Les contenus des tubes de transformation et de contrôle vont être mis en culture afin de vérifier les effets de la transformation. Choisir un ensemble de milieux permettant de sélectionner les bactéries transformées, de mettre en évidence les propriétés acquises par les bactéries à l’issue de la transformation. Pour chaque milieu ensemencé, décrire les résultats prévisibles de la culture …

8. Disposer sur votre table 4 boîtes de culture : 2 LB/amp, 1 LB/amp/ara et 1 LB. Marquer chaque boîte –pGLO ou +pGLO comme indiqué sur le schéma …

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9. Retirer les tubes de la glace et, au moyen d’une micropipette à embout stérile, ajouter 250 µl de bouillon de culture (tube LB) à chaque tube. Mélanger en agitant les tubes. Incuber les tubes 10 minutes à température ambiante.

10. Au moyen d’une anse, prélever une goutte de la suspension bactérienne de transformation ou de contrôle pour la déposer sur le milieu de culture approprié.

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11. Etaler cette goutte de suspension bactérienne à la surface du milieu de culture. Renouveler l’opération pour chacune des boîtes de culture

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12. Fermer, retourner, empiler et marquer vos boîtes de culture et les placer à l’incubateur 37°C jusqu’au lendemain.

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Récupérer les boîtes de culture bactériennes. Observez les à la lumière naturelle ou à l’aide d’une lampe UV