Évaluation du volume sanguin chez le rat

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Table des matières

INTRODUCTION        2

MATERIEL ET METHODES        3

1. Préparation du rat        3

2. Préparation et canulation de la veine jugulaire et de l’artère carotidienne        3

3. Injection du Bleu Evans        3

4. Prélèvement sanguin        4

5. Analyses du prélèvement sanguin        4

RESULTATS ET CALCULS        4

DISCUSSION        6

CONCLUSION :        6

INTRODUCTION

Le but de cette séance de travaux pratiques et de déterminer la volémie d’un rat. Celle-ci correspond à l’ensemble du volume plasmatique et du volume globulaire circulant dans l’organisme permettant notamment le transport de l’O2 et des substances absorbées dans le tube digestif aux tissus, mais aussi le retour du CO2 aux poumons et des produits du métabolisme aux reins. Le sang participe également à la régulation de la température corporelle et à la distribution d’agents notamment hormonaux qui contrôlent les activités cellulaires. Pour mesurer ce volume, on utilise une méthode de détermination indirecte. Cette méthode est basée sur l’injection d’un traceur dans le réseau sanguin, après quelques minutes on mesure la concentration de ce traceur dans le sang, ce qui va nous permettre de déterminer le volume sanguin du rat.

MATERIEL ET METHODES

1. Préparation du rat

Pour pouvoir mesurer la volémie de notre rat, nous devons tout d’abord le peser à l’aide d’une balance de précision (son poids sera utilisé pour les calculs et pour savoir le volume nécessaire des différentes solutions que nous aurons à injecter). Ensuite, nous l’anesthésions à l’aide d’une boite d’induction dans laquelle notre rat va respirer un mélange air/isoflurane à 4,5 % pendant 1 à 2 minutes.

Une fois le rat placé sous anesthésie, nous le plaçons sur une planche à contention et l’anesthésie est maintenue par un « masque » contenant aussi le mélange air/isoflurane entre 1,5 et 2 %. Il sera aussi mis sous une lampe chauffante afin de maintenir son corps au chaud. Notre animal est ensuite fixé par ses membres antérieurs et postérieurs sur le dos sur la planche de contention.

2. Préparation et canulation de la veine jugulaire et de l’artère carotide

Après la préparation de notre rat, nous procédons à la préparation de la carotide. Pour cela, on incise au niveau de la trachée à l’aide de gros ciseaux et on dilacère les tissus avec des pinces incurvées. Une fois la carotide trouvée, on l’isole du nerf vague et on effectue deux nœuds lâches, en haut et bas de notre portion de travail.

La préparation de notre carotide étant faite, nous canulons ensuite notre veine jugulaire, se situant au niveau des 2 pattes antérieures de notre rat. Après incisions et dilacération, on isole notre veine à l’aide de 2 fils en effectuant une ligature serrée du côté céphalique et un nœud lâche du côté cardiaque. Puis, on fait une incision transversale de la paroi de la veine, le plus proche possible de notre ligature serrée. On introduit ensuite un cathéter à robinet (contenant de l’héparine afin d’éviter toute coagulation du sang durant la procédure) dans le sens cardiaque tout en serrant notre nœud lâche, afin de maintenir en place ce dernier. On injecte alors notre solution d’héparine dans la veine jugulaire à l’aide d’une seringue.

Pour finir, nous procédons à la canulation de notre carotide préparée précédemment. Pour cela, on insère un clamp vasculaire afin de couper momentanément la circulation sur notre portion de travail et on serre notre nœud lâche du côté céphalique. Ensuite, on incise et on insère notre cathéter dans le sens cardiaque, contenant également de l’héparine, et on serre notre nœud lâche du bas pour maintenir le cathéter. On injecte également la solution d’héparine dans notre carotide (nos 2 seringues contenaient 0,74 mL d’héparine car on avait 0,2 mL d’héparine pour 100 g de poids vif de rat). Ainsi, le cathéter placé dans cette artère nous permettra de collecter le sang.

3. Injection du Bleu Evans

On procède ensuite à l’injection, par le cathéter de notre veine jugulaire, de 0,37 mL de notre indicateur coloré (on avait 0,1 mL d’indicateur pour 100 g de poids vif de rat). Celui-ci ne doit pas modifier significativement le fonctionnement physiologique du rat, pour cela nous utilisons du Bleu Evans car il possède du pH neutre, ne modifie pas l’osmolarité du sang et ne diffuse pas hors du système sanguin. Par la suite, nous rinçons notre cathéter à l’aide de sérum physiologique afin de perdre le moins de traceur possible et ainsi de ne pas fausser nos résultats.

4. Prélèvement sanguin

C’est seulement 2 à 3 minutes après avoir fini d'injecter l’indicateur, que l’on prélève 5 mL de sang environ par le cathéter de la carotide, afin d’éviter toute évacuation par le système rénal mais aussi pour laisser l’indicateur se diluer de façon homogène dans le système vasculaire de notre rat.

Pour récupérer le sang, on retire le clamp vasculaire, ce qui fait remonter le sang dans notre cathéter. Le sang prélevé est récupéré dans un tube à centrifugation.

5. Analyses du prélèvement sanguin

Pour finir, nous plaçons notre tube contenant le sang dans une centrifugeuse afin de séparer les éléments figurés du plasma, ce qui nous permettra d’évaluer le volume total et le volume plasmatique du sang centrifugé. Pour cela, on centrifuge pendant 10 minutes à 5000 tours/minutes.

Après centrifugation, on récupère 1 mL de plasma obtenu que l’on mets dans une cuve à spectrophotomètre contenant 1 mL de sérum physiologique. On mesure ensuite l’absorbance, après avoir fait le blanc avec du sérum physiologique, à une DO de 580 nm (afin d’avoir une longueur d’onde la plus optimale pour mesurer la concentration en Bleu Evans) et pour finir, on analyse les résultats obtenus et on en déduit la concentration du plasma en Bleu Evans par une courbe d’étalonnage. Ces valeurs nous permettront ainsi d’évaluer le volume sanguin circulant chez notre rat.

NB : Lors de l’injection du traceur notre rat est décédé, pour les résultats et calculs nous avons donc utilisé les données d’un autre groupe.

RESULTATS ET CALCULS

Avant centrifugation le sang présent dans le tube est homogène et après centrifugation de notre échantillon sanguin nous pouvons observer un mélange hétérogène avec  trois phases différentes. [pic 6]

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Nous pouvons constater qu’il y a une première phase sur le dessus qui est plus claire, une deuxième au milieu, moyennement foncée et un troisième très foncée au fond du tube. On obtient donc du plasma qui correspond à la phase claire. La coloration bleu de chaque phases montre bien la présence du traceur dans tout le sang.