Détermination du volume sanguin chez le rat

Compte rendu du TP 2 de physiologie animale : Détermination du volume sanguin chez le rat

Introduction :

La connaissance, chez le rat, du rapport de la masse sanguine sur la masse corporelle étant importante pour entreprendre des expérimentations complémentaires les étudiants ont dû déterminer le volume sanguin.

Avant cela, il faut établir le volume plasmatique ainsi que le taux d’hématocrite du rat. Le plasma est un élément constituant du sang, tissu conjonctif : il se compose d’éléments solides, appelés éléments figurés, qui sont dispersés dans un fluide, le plasma. Il est déterminé par un dosage indirect en utilisant un traceur, choisi pour sa non toxicité, sa diffusion ciblée dans l’appareil circulatoire de manière homogène. Le traceur utilisé au cours de cette séance est le bleu Evans, il est de concentration connue et a été injecté dans l’appareil circulatoire de l’animal. De plus le bleu Evans est un traceur spécifique dans la détermination du volume plasmatique car il se fixe à l’albumine, présente uniquement dans cet élément du sang. La connaissance de la concentration de ce traceur a permis aux étudiants de déterminer le volume plasmatique par un dosage indirect de spectrophotométrie. 

L’hématocrite correspond à la proportion d’élément figuré présent dans le sang par rapport au volume sanguin total. Il est exprimé en pourcentage et correspond à la mesure de la hauteur de l’espace occupé des éléments figurés du sang par rapport à la mesure de la hauteur de celui occupé par le volume de sang total.

Matériels et Méthodes :

 Pour commencer, il a fallu attacher le rat anesthésié sur le dos avec quatre lacets noués au niveau des articulation des pattes antérieurs et extérieurs. Le rat a dû être positionné en croix sans que ses membres soit trop tendus. 

1.Mise en place d’une canule dans la veine jugulaire 

Afin de pouvoir réaliser les trois premières manipulations il était nécessaire de libérer un champ opératoire précis. Tout d’abord il a fallu inciser le rat entre les deux os de la mâchoire puis couper la peau jusqu’au haut du sternum. Par la suite, la peau, le tissus conjonctif et les glandes salivaires ont été écartés. Les veines jugulaires se trouvent de part et d’autre du muscle sterno-cléido-mastoïdiens. Après en avoir isolée une, il a fallu faire une ligature au niveau de la bifurcation céphalique et préparer un nœud au niveau du triangle cardiaque. Une fois ces choses faites,  une incision a été faite au ¾ (en partant de la base) du triangle cardiaque. La canule a été insérée dans la veine jusqu’à la base du triangle cardiaque puis la ligature a été serrée et la canule quant à elle fut retiré doucement pour coincer l’olive de celle-ci dans la ligature. (L’olive correspond au bout de la canule qui a une forme particulière et est maintenue par le nœud ). Afin de vérifier si la canule a été correctement positionnée, 0.5 ml de solution, composée d’eau physiologique et d’héparine ont été injectés à travers la canule. Si aucun liquide n’a sorti, alors la canule a été bien posée.

2.Mise en place d’un cathéter dans la carotide 

        La carotide se trouve sous le muscle sterno-cléido-mastoïdiens, en profondeur. Il était important de ne pas déchirer le muscle. Après avoir localisé la carotide, il a fallu la séparer des nerfs qui l’entourent à l’aide des pinces. Par la suite, le cathéter a dû être préparé. Pour cela, le cathéter a été taillé en biseau d’un côté. Ensuite, à l’aide de la seringue, quelques gouttes d’héparine ont été misent dans le cathéter. Pour finir, le côté non biseauté a été chauffé et fermé. A l’aide d’un fil, la carotide a été ligaturée le plus haut possible du côté céphalique. Préparer deux nœud lâches ont été placés au centre de la carotide. Puis la pince à artère a été mise le plus bas possible. La carotide a alors pu être incisée le plus près de la ligature céphalique et le cathéter a été inséré. Les nœuds ont été ensuite serrés. Les nœuds ne devaient pas être serrés sur le biseau. Afin de vérifier le bon positionnement du cathéter, la pince à artère a dû être légèrement ouverte. Si le sang coulait dans le cathéter, c’est que celui-ci était alors bien placé. Pour prélever du sang, un tube a hémolyse contenant une goutte d’héparine a été préparé. Lorsque le tube fut prêt, la pince à artère a pu être ouverte, le bout du cathéter a été couper au niveau de la fermeture et 0.5 ml de sang ont pu être récolté dans le tube à hémolyse hépariné puis la pince à artère a été refermée. Pour nettoyer le cathéter, 1 ml de sérum physiologique hépariné a été pris, la pince à artère a été ouverte et le contenu de la seringue a pu être injecté dans le cathéter. Pour finir la pince à artère a été refermé.

3.Injection du bleu Evans

        La solution mère de bleu Evans était à une concentration de 0.025 g pour 100 ml de solution. Or, la dose à injecter était de 0.05 mg pour 100 g de rat. La masse de bleu Evans a donc été calculé d’après la formule suivante :

        [pic 1][pic 2]

Ci représente la concentration de bleu Evans à injecter qui est de 0.05/100, mrat correspond à la masse du rat et est exprimé en g et mi correspond à la dose à injecter exprimée en mg.

Pour déterminer le volume de solution mère à injecter, le calcul suivant a dû être réalisé.

[pic 3]

Vinj correspond au volume de solution mère à injecter (ml), Vsm représente le volume de mère (100 ml) et mbe est la masse de bleu Evans contenue dans 100 ml de solution mère (25 mg). 

        La quantité de solution mère à injecter a donc été calculé puis, ce volume a été introduit dans la canule jugulaire et cette canule a été directement vidée de toute solution mère car 0.5 ml de sérum physiologique ont été injecté par la canule.

4.Prélèvement du sang

        Impérativement 5 min après injection du bleu Evans un prélèvement de sang a été effectué grâce à le cathéter carotidien. Pour cela le cathéter a été coupé au niveau de la soudure puis la pince à artère a été ouverte. Après avoir prélevé environ 0,5 ml de sang dans un tube à hémolyse hépariné, la pince à artère a été refermée. Le sang prélevé a ensuite été centrifugé 10 min à environ 1500 g/min.

5.Détermination du volume sanguin

        5.1 Détermination du volume plasmatique

Pour commencer, il a fallu déterminer le volume plasmatique total. Pour cela, après centrifugation, le plasma étant situé dans la partie supérieur du tube, il a été récupéré à mis dans une cuve à spectrophotomètre. Une gamme étalon a ensuite été faite d’après le tableau suivant : 

Tableau 1 : Tableau reprenant la gamme de dilution réalisée

Une fois la gamme de dilution réalisée et afin de créer une courbe étalon, il a été nécessaire de déterminer la longueur d’onde maximale. Pour se faire, un échantillon a été passé au spectrophotomètre et testé sur toutes les longueurs d’onde du spectre visible soit de 500 nm à 700 nm. La longueur d’onde retenue est la longueur d’onde maximale. Après cela, la gamme étalon a été passé à son tour au spectrophotomètre avec la longueur d’onde maximale afin de tracer la courbe étalon. Le prélèvement de plasma de rat a ensuite été testé. Pour déterminer la concentration en bleu Evans dans le plasma de rat, il a fallu reporter son absorbance (DO) sur la courbe étalon sans oublier le facteur de dilution. Le volume plasmatique (Vp) ainsi que le pourcentage de plasma par rapport au poids de l’animal (Vpp) ont ensuite été calculés avec les formules suivantes : 

[pic 4]

[pic 5]

Vp est exprimé en ml.  mbeinj correspond la masse de bleu Evans injecté dans la canule jugulaire en mg et Cbe représente la concentration de bleu Evans dans la solution injecté en mg/ml. Vpp est exprimé en %. 

        5.2 Détermination du volume sanguin total

        Afin de connaître le volume total de sang dans l’animal, il fut nécessaire de calculer le taux d’hématocrite. Pour cela, la formule suivante a été utilisée.[pic 6]

[pic 7]

Th représente le taux d’hématocrite, h et H sont exprimé en cm.

[pic 8]

Le volume sanguin total (Vst) a donc pu être déterminé grâce aux formules suivantes: