Clonage de morceaux d'adn du phage lambda

grâce à une ligase. Une ligase est une enzyme qui est capable de lier de façon covalente deux molécules d'ADN en une.

A la suite de cette manipulation on obtient des ADNrecombinants. On doit maintenant les introduire dans les bactéries afin de les multiplier. On réalise une transformation des bactéries par les produits de la ligation.

Le lendemain, après avoir isolé les clones positifs et amplifié le plasmide (étape réalisée par les enseignants), on extrait ce plasmide des bactéries et on fait une digestion par des E.R des plasmides que l'ont vient de purifier.

En conclusion de ce TP on devrait obtenir des fragments d'ADN lambda clonés.

RESULTATS ET DISCUSSION

Analyse par électrophorèse de fragments d'ADN:

Le TP de bio 57 est composé de deux analyses par électrophorèse sur gel d'agarose. L'électrophorèse en gel est utilisée pour séparer les macromolécules biologiques en fonction de leurs tailles et de leurs charges électriques. Le gel est constitué d'une matrice de polymère baignant dans un tampon conducteur. Sur ce gel les fragments de plus petites tailles se retrouvent le plus loin du puits de dépôt car leur poids moléculaire est moins important que les ADN ayant un poids moléculaires plus élevé et les forces de glissements sont donc réduites. Pour visualiser les bandes d'ADN sur ce gel on utilise du bromure d'éthidium (BET) qui est un agent d'intercalation couramment utilisé comme marqueur d'acide nucléique dans les laboratoires de biologie moléculaire. Lorsqu'il est exposé à des rayonnements ultraviolets, il devient fluorescent avec une couleur rouge-orangée, 20 fois plus intense lorsqu'il est lié à l'ADN.

La première analyse par électrophorèse est effectuée après les étapes de digestion et de ligation des fragments d' ADN lambda et de pBluescript.

Voici la photo du gel obtenu après électrophorèse:

Photo n°1: Analyse par électrophorèse des fragments d'ADN

Nous constatons sur cette photo qu'il n'apparait aucune bande même le marqueur de taille moléculaire n'a pas fonctionné. Cela est certainement due à la perforation du gel lors du dépôt de l'ADN dans les puits , ce dernier a donc été dilué dans le tampon.

Normalement les résultats attendus seraient les suivants:

Puits n°1: Marqueur de taille moléculaire qui joue le rôle de témoin et de contrôle.

Puits n°2: On devrait obtenir théoriquement 13 bandes qui correspondent aux 13 fragments d'ADN lambda obtenues suite à une digestion par les enzymes ECO R1 et HIND III. Cependant les fragments de taille similaires ou proches seront représentés par une seule bande.

Puits n°3: Lors de la digestion du plasmide pBluescript par ECO R1 et HIND III on obtient deux fragments, un fragment de 12 paires de bases (pb) et un autre de 2949pb. Ainsi théoriquement on devrait obtenir deux bandes correspondantes aux deux fragments du plasmides pBluescript. Mais le marqueur de taille moléculaire ne permet pas de visualiser des bandes inférieurs à 250pb, par conséquent une seule bande apparaîtra sur le gel d'agarose à environ 3000pb.

Beaucoup de facteurs peuvent erroner les résultats attendus. Ainsi pour éviter au maximum les artefacts on pourrait utiliser plus d'enzyme de restriction, plus de temps ou encore réaliser cette analyse avant l'étape de ligation.

La seconde analyse est effectuée à la fin de notre TP, après avoir réalisé l'extraction du plasmide qui a été amplifié, et réalisé la digestion de ces plasmides par des E.R.

On a donc fait migrer sur un gel d'agarose 1% les fragments d'ADN que l'on a produits pendant les digestions.

Voici la photo du gel obtenu après électrophorèse:

Photo n°2: Analyse par électrophorèse des fragments d'ADN clonés

Sur cette photo on constate que nos fragments d'ADN ont bien migré sur le gel d'agarose, tout comme le marqueur de taille. Pendant le TP j'ai déposé mes solutions dans les puits n°2 , n°3 et n°4.

Ces puits correspondent respectivement à trois solutions, une de clônes négatifs (puits n°2) et deux de clones positifs (puits n°3 et puits n°4).

Les clones négatifs sont des bactéries qui ont inséré que le plasmide pBluescript (c'est à dire sans insert). Les clones positifs sont des bactéries qui ont inséré un ADN recombinant (pBluescript + ADN lambda).

Ce que l'on observe:

Puits n°1: Marqueur de taille moléculaire qui joue le rôle de témoin et de contrôle.

Puits n°2: On observe une bande qui se situe, en comparant au marqueur de taille, à environ 3000pb. Ce qui correspond ,à quelques paires de bases prés, à exactement la taille du plasmide pBluescript (2961pb). Ceci est logique puisque nous avons mis dans le puits n°2 les clones négatifs.

Puits n°3: Le puits n°3 correspond à un de mes clone positif . Nous constatons sur la photo que seulement deux bandes ont été obtenu. On retrouve une première bande à environ 5000pb et une seconde à environ 8000pb. On peut supposer que ces deux bandes correspondent à des plasmides recombinants non digérés. C'est à dire que ce sont des clones de plasmide qui contiennent un insert d'ADN lambda différent. On en déduit que la digestion des clones, par des enzymes de restrictions, effectuée avant l'électrophorèse a été mal réalisé ou n'a pas eu le temps de se réaliser proprement. Ainsi on n'a pas obtenu de bande correspondant à des fragments d'ADN lambda cloné.

Puits n°4: Le puits n°4 correspond à mon deuxième clone positif. Sur cette photo on observe plusieurs bandes réparties à différente taille de bp.

Tout d'abord on constate qu'il y a une bande au niveau de 3000pb, celle-ci correspond au plasmide pBluescript cloné qui a été digéré. Ensuite on identifie une bande à environ 1500pb, on peut supposer qu'elle correspond à un fragment d'ADN lambda cloné. Ces deux premières bandes montrent que l'on a bien cloné et digéré un plasmide recombinant avant cette analyse par électrophorèse.

Cependant, on constate qu'il y a aussi dans ce puits deux bandes au niveau 6000 et 8000bp. Comme on l'a vu auparavant on peut supposer qu'elles correspondent à des plasmides recombinants non digérés.

Au vue de ces résultats pour le puits n°4, on peut dire que ma manipulation pour ce clone a été à moitié réussie. Ainsi nous avons obtenu une bande correspondant à un fragment d'ADN lambda et une autre de pBluescript, donc la digestion a bien été réalisé. Cependant on retrouve des plasmides non digérés par les enzymes de restriction, donc la digestion n'a pas marché pour cela.

Ensemencement des bactéries sur boîtes de Pétri:

Le TP de BIO57 est composé d'une étape où l'on étale des bactéries transformées(avec un plasmide pBluescript recombinant ou non-recombinant) sur des boîtes de Pétri contenant du milieu de culture. Cette étape permet d'identifier des clones intéressants.

Pour cela on utilise le fait que le plasmide possède un gène de résistance à un antibiotique (AB). Ainsi dans les boîtes de Pétri on introduit de l'ampicilline (=AB), ce qui va empêcher les bactéries sans plasmide(=non transformée) de pousser puisque celle-ci n'auront pas le gène de résistance à un AB.

Par ailleurs pour faire la différence entre un clone de bactérie contenant un plasmide recombinant, d'une bactérie contenant un plasmide non-recombinant, on utilise la méthode de sélection blanc-bleu. L’insertion du fragment d’ADN conduit a une interruption du gène lacZ responsable de la couleur bleue dans le plasmide. Ainsi la colonie de bactérie contenant un plasmide recombinant sera blanche et la colonie de bactérie contenant un plasmide non-recombinant sera bleue.

Pendant ce TP on utilise trois boîtes de Pétri :

une première avec comme solution notre produit de transformation des bactéries avec un plasmide recombinant(ADN lambda + pBluescript).

Une deuxième avec comme solution notre produit de transformation des bactéries avec un plasmide recombinant en ayant utilisé deux fois plus d'ADN lambda.

Une troisième avec comme solution notre produit de transformation des bactéries avec seulement un plasmide pBluescript digéré.

Le lendemain matin de notre TP on a récupéré les boîtes de Pétri, où les bactéries se sont multipliées.

Sur mes boîtes de Pétri je n'ai pas vraiment obtenu les résultats attendu. En effet toutes mes boîtes présentaient des colonies bleus, en abondance dans les boîtes 1(lambda + plasmide recombinant) et 2(2*lambda + plasmide recombinant), de plus seule la première boîte présentait quelques colonies blanches. Théoriquement on aurait du obtenir pratiquement que des colonies blanches dans la première boîte de Pétri. Puisque cette boîte correspond au clone de plasmide