Suivi des analyses microbiologiques des denrées alimentaires et de l’eau réalisées au niveau de laboratoire d’hygiène

Introduction

 L'hygiène  dans  le  secteur  alimentaire  est  d'une  importance  capitale.  En fait, les micro-organismes peuvent proliférer et atteindre un seuil dangereux quand ils trouvent les conditions optimales pour leur prolifération.  C'est  pourquoi  les  règles  d'hygiène  doivent  être  respectées  d'une façon  particulièrement  stricte .

Pour  s’assurer que l’hygiène et les conditions de production sont satisfaisantes et en accord avec la règlementation, certaines normes adoptées par la législation  fixent les limites acceptables de présence de microorganismes donnés dans des produits bien définis. Aussi  le contrôle de la qualité de l’eau est indispensable .Ce contrôle peut être soit bactériologique  en décelant  la présence des bactéries soit  physicochimique pour savoir la teneur de certains éléments. Et tout doit être en conformité avec les normes.

Le laboratoire d’hygiène de Tozeur où j’ai effectué  mon stage est l’un des  laboratoires de contrôle des denrées alimentaires ainsi que de l’eau pour la détermination de leur qualité. De ce fait, le travail effectué au sein du laboratoire d’hygiène consiste à dénombrer les indications technologiques (les germes totaux), les indicateurs de la pollution fécale (coliforme totaux, Escherichia coli), ainsi que les germes pathogènes (Salmonella, Staphylocoques Aureus, et les microorganismes anaérobies-sulfitoréducteurs) et  les levures et moisissures dans les aliments et de l’eau.

L'objectif de l'analyse microbiologique est de rechercher des contaminants par identification des microorganismes et quantification du nombre de colonies. L’analyse microbiologique s'intéresse également à des germes témoins de mauvaises pratiques hygiéniques.

Pour chaque produit alimentaire, une liste de micro-organismes est établie par le législateur avec les taux de présence acceptables. Certains germes sont indésirables (salmonelles ou listéria, par exemple), d'autres doivent se trouver en quantité inférieure aux critères définis. Au-delà du rapport d'analyse, il est ensuite nécessaire d'interpréter le résultat et de rechercher les causes des éventuelles défaillances.  Ces analyses des aliments sont donc surveillées par des organismes compétents pour éviter des intoxications alimentaires. Aussi, ce laboratoire s’intéresse d’effectuer des analyses physicochimiques pour différents types d’eaux   pour s’assurer de leur  qualité et pour adopter les actions correctives convenables.

1. Présentation de laboratoire 

Le laboratoire d’hygiène et de protection de l’environnement de Tozeur a été inauguré en Novembre 2002. Il est dérigé par un médecin chef de service, un surveillant général et 3 techniciens supérieurs.

C’est un laboratoire polyvalent ou sont disponibles différents types d’analyses : Sérologie, Mycologie, Copro-parasitologie, bactériologie (eaux, aliments et produits biologiques), analyses physico-chimique des eaux…

Les différents types de prélèvement proviennent des dispensaires de santé de base, de la médecine scolaire, de différent établissement demandant (hôtels, pâtisseries, cafés…)

Afin de remplir toutes ses tâches, le laboratoire est subdivisé en plusieurs secteurs:

• Une salle de réception des différents prélèvements ou ils sont classés puis distribués aux différentes salles d’analyses.
• Un bloc analytique qui comporte autant de salles que de spécialités et s’occupant chacune d’un seul type d’analyse ; on trouve :

• Une paillasse de corpo-parasitologie ou on réalise un examen coprologique et parasitologie des selles ainsi que des eaux usées.
• Une paillasse pour l’analyse physico-chimique des eaux ou on traite différents types d’eau (eau de boisson, baignade, piscine…)
• Une salle pour analyses bactériologique des eaux (eau de boisson, eau minérale…).

• Une salle de stérilisation des milieux de culture et du matériel.
• Une salle de laverie et de stérilisation du matériel réutilisable (bouteilles, pote de prélèvement, verreries…).
• Un dépôt ou on stock les réactifs.
• Une salle de stockage des matériaux

2. Les Analyses microbiologiques des aliments

2.1. Objectifs 

 L’analyse  microbiologique  des  denrées  alimentaires  nous  permet  d’évaluer  l’état bactériologique  des  aliments  en  déterminant  le  taux  de  non-conformité.                      

Les aliments analysés proviennent des plats chauds et des plats froids (salades) lors de quatre  étapes : dressage, transport,  entreposage et  distribution.

2.2. Les germes recherchés pour les analyses des denrées alimentaires

Les  germes  recherchés  au  niveau  du  laboratoire  régional  d’hygiène  publique  sont: la  flore aérobie  mésophile  qui  reflète  la  qualité  microbiologique  générale  d’un  aliment, les coliformes fécaux et les coliformes totaux, les germes anaérobies sulfitoréducteurs (Clostrodium),  les  streptocoques  fécaux,  les  staphylocoques aureus, les salmonelles, les levures et  les moisissures.

2.3. Prélèvements des échantillons

Dans le but d’avoir des analyses de haute qualité, il est sans doute obligatoire de prélever d’une manière aseptique. Ainsi le manipulateur doit veiller à respecter son hygiène corporelle (surtout les mains) et vestimentaire. Il est aussi déconseiller de faire des prélèvements dans des zones de courant d’air.

2.4. Transfert des échantillons au laboratoire 

Le transfert des échantillons a été assuré à des températures voisines de +4°C dans une            glacière contenant des boites eutectiques préalablement congelées. Comme il s’agit des produits frais, le transport se fera le plus rapidement possible.

2.4. Techniques d’analyses bactériologiques des denrées alimentaires

2.4.1. Préparation de l’échantillon pour l’analyse 

25 grammes  de  chaque  échantillon  sont  pesés,  tout  en  étant  à  proximité  du  bec benzène,  à  l’aide  de  la  balance  de  précision  puis  ils  sont  transférés  d’une  manière  aseptique dans un sac de Stomacher stérile pour subir le broyage dans 225 ml d’eau peptonée tamponnée(EPT) stérile, constituant ainsi la solution mère (SM). L’EPT est  utilisé pour le pré-enrichissement  en permettant notamment de revivifier les microorganismes ayant subi des traitements sub-létaux.  

La préparation de la solution mère est considérée comme étant une 1ère dilution. Ainsi des  dilutions  décimales  allant  de  10-2 à 10-4 dans  l’eau  distillée  stérile  seront  préparées à partir de la solution mère (SM). Le facteur de dilution varie d’un échantillon à un autre.

2.4.2. Le procédé des analyses microbiologiques

Les  méthodes  d’analyse  des  denrées  alimentaires  débutent  par  la  préparation  de  la  solution mère,  et  après  elles  varient  en  fonction  du  germe  recherché  d’où  la  variation  du  milieu  de culture utilisé, de la température et du temps d’incubation.

2.4.2.1. Recherche des germes totaux

• Principe 

Le dénombrement des germes totaux (flore mésophile) concerne surtout les bactéries revivifiables après 72 heures d’incubation à 30°C dans un milieu nutritives de type gélose nutritive.

Il s’agit d’identifier des germes totaux (flore mésophile) en utilisant le PCA (Plate Cout Agar) comme milieu de culture .C’est est une gélose standard universelle utilisée pour le dénombrement des microorganismes saprophytes. En effet, le milieu contient des peptones comme sources d’azotes et du glucose comme source de carbones, l’extrait de levures apportant tous les facteurs de croissance nécessaire à la croissance des microorganismes.

• Mode opératoire

1 ml du produit à analyser et de ses dilutions décimales successives sont versés dans des boîtes de Pétri stériles. Puis une 1ère couche de milieu de culture PCA est versée. L’homogénéisation de mélange se fait par simple agitation manuelle. Une fois solidifié sur une surface froide, une 2ème couche de PCA  est versée pour empêcher le développement des bactéries à la surface de la 1ère couche. L’incubation se fait pendant 24-48 h à 30°C.

• Résultat 

La présence de ces germes provoque  un halo plus clair autour de chaque colonie.

2.4.2.2. Recherche des coliformes

• Principe 

Les coliformes sont des entérobactéries (bacille gram-, non sporulées, aérobies anaérobies facultatives). Elles fermentent le lactose avec production de gaz à32°C dans un milieu de type gélose nutritive. On utilise comme milieu de  culture le  VRBL (Violet cristal /rouge neutre/sels Biliaires/gélose Lactose) qui est spécifique des coliformes. En effet le cristal violet inhibe la croissance  des Gram + : ce qui rend le milieu sélectif des Gram -. L’indicateur coloré Rouge neutre  permet de différencier les coliformes lactoses + (coloration rouge foncé) des autres  entérobactéries lactose – (coloration jaune).