Compte rendu bactériologie

[pic 1]

LOPVET Romane, série 1 groupe A

BODLAIRE Hougbo série 2 groupe C

HALLOUIN Léa, série 2 groupe A

HAV318V TRAVAUX PRATIQUES DE BACTERIOLOGIE

Compte rendu de TP

Année 2021-2022                                                                                   M.

Introduction et Matériel…….. ……………………………………………………………………….3

TP1 première séance ……………………………………………………………………………………4

• I – Etude d’une entérobactérie
• II – Etude d’une bactérie de la peau

TP2 deuxième séance…………………………………………………………………………………..6

• I- Titrage d’un lysat de bactériophage
• II-Etude d’une entérobactérie
• III-Etude d’une bactérie de la peau

TP3 troisième séance…………………………………………………………………………………..10

• I-Coloration de GRAM frottis buccale
• II-Coloration de GRAM bactérie de la peau

Conclusion……………………………………………………………………………………………………13

Au sein de l’UE de microbiologie, des travaux pratiques nous permettent de comprendre et d’appliquer les cours théoriques.

           Ainsi, nous avons réalisé 3 séances de travaux pratiques dans le but d’assimiler les notions de manipulations stériles, d’isolements sur milieux gélosés, de tests ou encore de titrage de bactériophages. Nous avons également pu observer au microscope des bactéries dans différents états.

A l’issue de ces 3 séances, nous serons en mesure d’identifier et de décrire une bactérie. Mais aussi de connaître les différents milieux de culture, ainsi que les techniques utilisées en pratique de microbiologie.

 MATÉRIEL

• L’oese  ou anse = Elle est utilisée pour les ensemencements et prélèvements en milieu solide ou liquide. Sa stérilisation s'effectue dans la flamme bleue du bec Bunsen.
• Bec de bensen
• Lame
• Lamelle
• Microscope optique
•  La pipette Pasteur : Elle permet de prélever des milieux liquides ou de réaliser des isolements.
• Les tubes  en verre (tubes à essai)
• Les tubes en plastique (tubes à hémolyse).
• Les boîtes de Petri : elles servent à la culture de bactéries sur milieux solides.
• Pipette gilson : La micropipette P1000 permet de prélever de 0.2 à 1 mL. La micropipette P200 permet de prélever de 20 à 200 µl et a micropipette P20 permet de prélever de 1 à 20 µl.

Le but principal de cette 1ère séance va être l’observation d’une entérobactérie, et d’une bactérie de la peau.

I - Etude d’une entérobactérie

Tout d’abord, rappelons ce qu’est une entérobactérie : ce sont des bactéries de la famille des bacilles (bactéries en forme de bâtonnet) à Gram négatif

Donc le but de cette séance va être de mettre en évidence ces différents paramètres.

Notre groupe possédait le tube n°9

1. Nous avons commencé par réaliser un état frais

Rappel : C’est une observation des bactéries vivantes qui permet de distinguer leur forme et d’apprécier leur mobilité. Une préparation à l'état frais consiste à enfermer entre lame et lamelle une suspension de micro-organismes vivants.

Ensuite nous l’avons déposé sur une lame puis recouvert d’une lamelle afin de l’observer au microscope, avec une lumière peu intense.

Voici ce que nous pouvons observer au grossissement  x100 en immersion :

[pic 2]

Nous pouvons majoritairement observer des formes de bâtonnets. Nous pouvons également observer des bactéries avec une mobilité importante. Donc présence de flagelle(s) ou de cils permettant le déplacement.

1. Nous avons ensuite réalisé une coloration de Gram

Tout d’abord nous avons préparé et fixé le frottis sur une lame. Puis nous avons réalisé la coloration en suivant les étapes du polycopié.

Nous avons ensuite pu réaliser une observation au microscope en faisant attention de ne pas recouvrir avec de lamelle, et en utilisant une lumière assez forte pour distinguer les bactéries.

Nous observons principalement des bactéries de couleur rose. Ce qui indique donc des Gram - [pic 3]

La coloration permet de mettre en évidence différents types de parois bactériennes. Puisque nous avons identifié ces bactéries comme des Gram-, nous pouvons dire que leur paroi comprend une fine couche de peptidoglycane qui est entourée par une membrane externe de nature phospholipidique.

 L’alcool-acétone pouvant dissoudre ces lipides, puis traverser la fine couche de peptidoglycane et enfin pénétrer dans le cytoplasme des bactéries. Il peut donc les décolorer, puis la safranine intervient et les colore secondairement en rose.

1. Puis nous avons procédé à un isolement

On a réalisé un isolement sur des milieux gélosés en boite de pétri, on a ensemencé des bactéries sur des milieux différents et on a mis à 37°C pendant 24h, les résultats seront donc décrits plus tard dans le compte rendu.

        II – Etude d’une bactérie de la peau

On rappelle que ce milieu contient du mannitol, si ce dernier est dégradé par les bactéries qui se développent, il y a production d’acides. Nous avons ensemencé une boîte de milieu de Chapman avec l’empreinte de nos doigts, enrichis en bactéries par des frottements du cuir chevelu.

Puis nous avons déposé notre boîte dans l’étuve, en veillant à ce qu’elle soit bien fermée, et mise à l’envers.  Les résultats seront observés plus tard.

I- Nous avons commencé par réaliser un titrage de lysat de bactériophage.

Nous avions à notre disposition 9 tubes Eppendorf avec lesquels nous avons réalisé des dilutions et une souche indicatrice bactérienne.[pic 4]

Nous avons commencé par préparer la souche indicatrice, constituée de Escherichia coli XL1 Blue préalablement cultivée jusqu’à sa phase exponentielle. Nous avons prélevé 1,5 mL de cette culture, avant de la centrifuger, de jeter son surnageant et de suspendre le culot dans 0,6 mL de MgSO4 10-2M

Ensuite, nous avons utilisé nos bactéries indicatrices pour réaliser une gélose, que nous avons coulé dans une boite de LB agar, puis laissé se solidifier.

Nous avons également réalisé une succession de dilutions de phages dans du MgSO4 (de 10-1 à 10-8) dans des tubes Eppendorf de 1,5mL.

Une fois toutes ces étapes terminées, nous avons pu diviser notre boîte en 8 ‘’parts’’, et les noter de 10-1 à 10-8 avant d’y déposer des spots de 10 µl de chaque dilution sur la gélose. [pic 5]

Il a fallu par la suite laisser absorber la gélose sans bouger la boîte pendant une quinzaine de minutes, proche de la flamme du bec Bunsen. Avant d’y observer des plages de lyses isolées si l’expérience a fonctionné. Normalement, leur nombre donne le titre du lysat.