Cours L2 Biologie Moléculaire Jussieu

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Conséquence sur la structure de la double-hélice :

Dans une structure parfaite, les deux sillons ont la même taille et la même profondeur. En réalité, les angles sont différents, donc les sillons ont des tailles différentes. On a bien une rotation autour de l’axe mais l’enroulement n’est pas symétrique. Il y a une asymétrie de la double-hélice avec un grand et un petit sillon. Toutes les protéines qui interagissent avec l’ADN s’encastrent dans le grand sillon.

ADN de forme B.

L’ADN a une hélice droite de 20 Angtröms. Les bases ne sont pas empilées droites, elles sont décalées. Twist : décalage entre deux bases (36°). Tilt : angle entre deux bases (6°). Cela permet la flexibilité de l’ADN.

ADN de forme A.

L’hélice est droite de 26 Angström et beaucoup plus trapue. Les sillons et le positionnement des bases sont différents. L’hélice est dissymétrique, les paires de bases ne sont plus au centre.

ADN de forme Z ou ADN en zigzag.

L’hélice est gauche de 18 Angström.

~~> Voir tableau.

On trouve la forme A in vivo mais la forme Z ne se trouve certainement qu’in vitro. L’ARN double-brin a une conformation A.

Les liaisons hydrogènes.

Elles contribuent à la stabilité de la double-hélice. Les forces d’empilement sont hydrophobes entre les bases, elles peuvent être intrabrins ou interbrins. Elles contribuent à la stabilité. L’énergie d’empilement dépend des paires de bases.

Liaisons de Hoogsteen et triple hélice.

Il y a un appariement entre le T et le A grâce au H et au N. On peut avoir une base appariée à deux autres bases pour former une triple hélice. Ce n’est pas spécifique du A et T, mais peut aussi s’appliquer au C et G. Pour GC, la liaison de H n’est pas très stable contrairement à AT car il y a trois liaisons hydrogènes entre les bases. Ce phénomène se trouve aussi in vivo. Le brin complémentaire s’est désapparié pour former une triple hélice. Un fragment d’ADN reste simple brin et s’apparie ensuite.

Tautomérie des bases.

Les bases peuvent shifter vers d’autres conformations. Les quatre bases peuvent le faire. Il n’y a pas de conséquences graves mais il n’y a plus les mêmes capacités d’appariement que la forme initiale. S’il se produit un shift pendant le réplication, on a un ADN par mésappariement. Il peut être réparé mais si ce n’est pas le cas, il peut induire des mutations. Ce phénomène est très peu fréquent.

5-méthyl-cytosine (5MC) : la cinquième base.

Chez les Mammifères, 20 % des cytosines sont méthylées. Il n’y a pas d’incorporation dans l’ADN d’une base méthylée, la méthylation se fait ensuite grâce à une méthylase. Les méthylases reconnaissent des sites spécifiques et méthylent les bases spécifiquement, c’est un phénomène post-réplication. La méthylation est très importante car elle permet de contrôler le message extrinsèque.

Il y a de l’ADN chez les procaryotes, les eucaryotes et les phages. L’ARN est aussi le support de l’Information génétique. Il y a beaucoup de virus à ARN. Il existe plusieurs sortes d’ARN : l’ARN messager, l’ARN de transfert, les ARN ribosomiques. Il y a aussi des Arn non codants : les Arn structuraux.

Différences entre ADN et ARN :

* Ribose.

* L’uracile remplace la thymine.

La cytosine est fragile, elle perd facilement son groupement amine, c’est la déamination, qui donne l’uracile. Mais le système de réparation enlève l’uracile et met une cytosine à la place. Il y a de la thymine dans l’ADN pour pouvoir reconnaître les uraciles accidentels. Le ribose fragilise l’Arn et le rend facilement dégradable. L’Arn est instable, contrairement à l’ADN qui est plus stable grâce à la suppression de l’hydroxyle. L’ADN est un support, l’ARN un intermédiaire qui doit être renouvelé rapidement. Le ribose ne permet pas la forme B, l’ARN a donc une forme A. Au contraire, le désoxyribose permet la forme B, ce qui est plus pratique pour la régulation.

L’ADN est double brin et doit interagir avec les protéines, La forme B possède de grands sillons, ce qui permet l’incorporation des protéines. Il y a donc un désoxyribose dans l’ADN pour avoir de grands sillons. L’ARN est linéaire mais flexible, il se replie pour former des régions double-brins ; l’ARN a également une structure tridimensionnelle qui permet son interaction avec le codon. Sa structure est instable mais mobile. L’ADN est beaucoup moins flexible.

Les propriétés physicochimiques des acides nucléiques.

L’ARN est sensible à la dégradation, contrairement à l’ADN qui est résistant à l’action des bases alcalines. Pour l’ARN, la base s’attaque à la liaison phosphodiester et la coupe.

Hydrolyse acide : ARN : rien.

ADN : séparation des brins.

Hydrolyse alcaline : ARN : dégradation en mononucléotides.

ADN : séparation des brins.

Propriétés spectrales de l’ADN et de l’ARN.

Moyenne UV max : 260 nm.

Pour les protéines : 280 nm.

Phénomène d’hyperchromicité de l’ADN : à quantité égale, l’ADN double brin absorbe plus que le simple brin. Dans l’ADN double brin, les bases sont confinées alors que dans le simple brin, elles peuvent tourner et sont plus accessibles.

Hybridation de l’ADN.

Dénaturation : c’est une séparation des deux brins d’ADN par rupture des liaisons hydrogènes. Elle est réversible et s’effectue à haute température. L’hydrolyse est une séparation par rupture de la liaison phosphodiester de générations de bases libres.

Tm : température de fusion. C’est la température pour laquelle 50 % de l’ADN est dénaturé. Plus on a de paires G-C, plus le Tm est élevé (pour G-C, trois liaisons H, deux pour A-T).

La renaturation est l’hybridation. Une protéine ne s’hybride pas sur l’ADN, elle interagit avec lui. Pour dénaturer, on peut aussi utiliser des solutions de formamide ou d’urée.

Hybridation moléculaire.

Si les deux séquences sont complémentaires, il n’y a pas de mésappariement, l’Adn est stable. Si elles sont partiellement complémentaires, il peut y avoir des mésappariements, l’ADN est moins stable et donc, plus facile à dénaturer. Le nombre de mésappariements modifie le Tm, ainsi que la force ionique (NaCl, s’il y a une forte concentration en sel, le Tm est élevé) et le formamide ou l’urée.

Calcul du Tm :

Tm = 81,5 + 16,6 (log10 [Na+]) + 0,41 (% GC) – 600/N

N : taille de la sonde. Log10 [Na+] doit être inférieur à 0,5 M.

L’hybridation peut se faire en milieu liquide ou solide. Hétéroduplex : un simple brin de chaque, homoduplex : deux brins identiques. L’hybridation en milieu solide est la plus classique. L’ADN libre est la sonde, le fixé, la cible. L’hybridation peut se faire à une température plus élevée que le Tm : 25°C pour les grands fragments, contre 5°C pour les petits. La sonde va s’hybrider avec un des brins qui contient la séquence recherchée. On pourra ensuite détecter l’ensemble. La Tm dépend de la zone d’hybridation.

Pour ADN homologues : Tm = 2 (nb (A +T)) + 4 (nb (G + C))

On estime qu’1 % de bases non appariées diminue le Tm de 1,5 °C.

Hybridation sur colonie.

Chaque colonie bactérienne a un plasmide différent. On procède à une hybridation à la sonde radioactive, puis à une autoradiographie qui donne la localisation.

* Hybridation in situ par fluorescence, directement sur le chromosome.

* Puces à ADN (1 puce : 0,2 *0,2 mm). Chaque spot correspond à un seul gène. Rouge : faiblement exprimé. Vert : fortement exprimé.

Techniques classiques :

Southern : détection d’une séquence d’ADN spécifique dans un environnement de séquence d’ADN hétérologue : fait appel à l’hybridation.

Northen : détection de l’ARN, fait appel à l’hybridation.

Western : détection d’une protéine, fait appel à la détection antigène – anticorps.

La radioactivité est le marqueur le plus utilisé. Le précurseur le plus utilisé est le DNTP (actif en α).

L’enzyme.

Toutes les polymérases nécessitent une amorce et vont dans le sens 5’ 3’. On prend le brin en cours de copie et le sens de copie.

L’enzyme de restriction. Ce sont des endonucléases (qui coupent l’ADN