Expression Et Purification d'Une Protéine

e (clivage des peptidoglycanes membranaires), l’inhibition des DNases par l’EDTA (chélateur de cations divalents). Le Tris-HCl pH 8 permet l’équilibration du pH. La dénaturation des protéines et de l’ADN plasmidique et génomique est induite par le SDS 1 % et NaOH. L’acétate de potassium et l’acide acétique pH 5,2 permettent la neutralisation de NaOH et la renaturation de l’ADN plasmidique. L’élimination des protéines est réalisée par la méthode classique des extractions sélectives au phénol-chloroforme, et le phénol éliminé par traitement au chloroforme. L’ADN est précipité par l’éthanol absolu et l’échantillon est traité ou non à la RNase A 500 µg.µL-1 pour la dégradation des ARNs de faible poids moléculaire restants (Annexe I).

* Digestion de l’ADN plasmidique par les endonucléases BamHI et EcoRI :

6 échantillons sont traités, contenant chacun 10 µL d’ADN plasmidique. L’ADN plasmidique est ensuite digéré ou non par 2 unités d’enzymes de restriction BamHI et/ou EcoRI à 1unité.µL-1, en fonction des échantillons :

* pGEX + RNase

* pGEX + EcoRI

* pGEX + RNase + EcoRI

* pGEX-IDH + RNase

* pGEX-IDH + RNase + EcoRI

* pGEX-IDH + RNase + EcoRI + BamHI

* Electrophorèse horizontale en gel d’agarose :

L’ADN plasmidique est chargé négativement : entraîné par un champ électrique, il migre vers l’anode (pôle positif). Le gel d’agarose constitue un réseau de mailles permettant de séparer des composés en fonction de leur taille ; la fourchette de séparation dépend de la concentration en agarose. L’ADN plasmidique peut adopter différentes conformations, dont les trois suivantes, énumérées ci-dessous par ordre de mobilité électrophorétique de la plus lente à la plus rapide :

* ADN linéaire : extrémités libres, linéarisé par clivage des deux brins

* ADN circulaire relâché : intact, double brin, enzymatiquement détendu

* ADN circulaire surenroulé : intact, double brin, forme compacte

5 µL de BET sont ajoutés à l’agarose avant réticulation du gel ; le BET est un agent intercalant de l’ADN qui permet de suivre sa migration après trans-illumination aux U.V. (260 nm). 4 µL de solution de dépôt sont ajoutés aux échantillons, contenant : du glycérol 50% (alourdisseur), de l’EDTA (neutralisation des DNases), ainsi que du bleu de bromophénol et du bleu de xylène de cyanol, marqueurs de suivi de la migration. Les échantillons sont chargés sur un gel d’agarose 0,8% (séparation de 0,8 à 10 Kpb). Un marqueur de poids moléculaire d’ADN est également déposé, contenant des fragments linéaires d’ADN de phage lambda digérés par EcoRI et HindIII. Le tableau en Annexe I donne les valeurs de poids moléculaire et de distance de migration des fragments de ce marqueur (piste 7 du gel électrophorétique).La migration s’effectue à 100 V pendant ~ 2 hr dans un tampon TBE contenant du Tris (tampon), du borate (ion permettant la diffusion du courant électrique dans le gel d’agarose) et de l’EDTA.

La représentation graphique du log de la taille des fragments (pb), en fonction de la distance de migration (cm) des fragments, du marqueur de poids moléculaire, présente une zone de linéarité/proportionnalité qui permet de déduire la taille d’un fragment dont la distance de migration est connue.

[pGEX + EcoRI]: Une large bande est observée à 1,7 cm. pGEX ayant été clivé par EcoRI, cette bande devrait donc correspondre à la forme linéaire du vecteur, à moins qu’elle ne masque une autre bande de plus faible distance de migration. De plus, cette bande est trop large pour qu’elle puisse servir à déterminer la taille du plasmide à partir de cette piste. Une longue traînée est observée, avec une grande distance de migration. Cette traînée n’apparait pas sur [pGEX + RNase], elle correspond donc aux ARNs de faible poids moléculaire n’ayant pas été éliminés lors de l’extraction de l’ADN plasmidique.

[pGEX + RNAse]: Plusieurs bandes sont observées et le vecteur n’est pas digéré ce qui signifie qu’il est présent sous plusieurs formes (circulaire relâché et surenroulé). Une bande ce situe à 1,7 cm et une suite de plusieurs bandes de haut poids moléculaires apparaissent, sortant de la limite de résolution de notre gel (<1 cm).

[pGEX + RNAse + EcoRI]: Deux bandes sont observées : à 1,7 cm et 1,5 cm, ce qui signifie que la digestion de pGEX par EcoRI n’a pas été complète et que tous les plasmides n’ont pas été linéarisés, et que l’ADN plasmidique est présent sous deux formes. Par comparaison avec [pGEX + RNase], il est déduit que la bande à 1,5 cm qui n’apparait pas sur [pGEX + RNase] et est cachée sur [pGEX + EcoRI] correspond en réalité à l’ADN plasmidique de forme linéaire, totalement digéré par EcoRI sur [pGEX + RNase + EcoRI], et que la bande à 1,7 cm de [pGEX + RNase], [pGEX + EcoRI] et [pGEX + RNase + EcoRI] correspond finalement à une forme surenroulée de l’ADN du vecteur qui permet une migration plus rapide que la forme linéaire. De plus, sur [pGEX + RNase], les bandes de haut poids moléculaire ne correspondant à aucune des deux formes, il s’agit en réalité de formes concatémère de plusieurs plasmides.

Enfin, la taille du plasmide pGEX « vide » peut être déterminée (1,5 cm): 5413 pb.

[pGEX-IDH + RNAse]: Une seule bande est observée à 0,95 cm. Cette bande pourrait correspondre à l’ADN plasmidique sous forme circulaire relâchée ou surenroulée, ne pouvant correspondre à une forme linéaire puisque le plasmide n’a pas été digéré. Il est toutefois peu probable qu’elle corresponde à une forme surenroulée à cause d’une manipulation un peu trop brutale qui aurait détruit les liaisons maintenant les formes surenroulées. Le plasmide avec l’insert IDH a une masse plus importante, ce qui peut expliquer sa migration plus courte en comparaison avec la bande à 1,7 cm de [pGEX + RNase](forme surenroulée). Comme dans la piste [pGEX + RNase], la présence de formes concatémères de haut poids moléculaire est observée.

[pGEX-IDH + RNAse + EcoRI]: Une seule bande est observée à 1,35 cm qui correspond à la forme linéarisée de pGEX-IDH, ayant été digéré par EcoRI. Cette bande a migré moins loin que la bande à 1,5cm de [pGEX + RNase + EcoRI] car le plasmide contient plus d’ADN avec l’insert IDH. A partir de cette piste est déduite la taille de pGEX-IDH : 7017 pb.

[pGEX-IDH + RNAse + EcoRI + BamHI]: Deux bandes sont observées : à 2,3 cm et 1,5 cm, car pGEX-IDH a été digéré par EcoRI et BamHI. Par comparaison avec [pGEX + RNase + EcoRI], il est déduit que la bande à 1,5 cm correspond au plasmide pGEX « vide »/seul. La bande à 2,3 cm correspond donc à l’insert IDH seul : 1355 pb. Nous pouvons comparer ce résultat avec celui obtenu à partir de la séquence d’IDH : d’après la séquence, IDH contient 417 codons soit 1251 pb. Les résultats obtenus sont donc proches et cohérents : 1251 ≈ 1355 pb. Nous pouvons également comparer ce résultat avec en soustrayant la taille du plasmide pGEX « vide » à celle du plasmide pGEX-IDH (cf [pGEX + RNase + EcoRI] et [pGEX-IDH + RNase + EcoRI), soit : 7017 – 5413 = 1604 pb ≈1355 pb.

II. Surexpression de l’IDH :

* Pré-culture et sélection des bactéries E. coli JM103/pGEX-IDH :

La pré-culture de bactéries E.coli a été créée à partir de l’ensemencement d’un bouillon BL (Bactocryptone Levure) par une colonie isolée d’E.coli prélevée sur boîte de pétri. Le bouillon BL est un milieu riche favorisant la croissance bactérienne : source d’acides aminés, azote,… 50 µg.µL-1 d’ampicilline ont été ajoutés afin de permettre la sélection négative des bactéries E. coli JM103/pGEX-IDH ayant incorporé le plasmide pGEX-IDH contenant un gène de résistance à l’ampicilline. La pré-culture est maintenue sous agitation mécanique et à 37°C. La DO de la pré-culture (dilution au 1/10è dans la cuve spectrophotométrique), mesurée à 595 nm, est de 0,425. 23,5 mL de cette pré-culture sont prélevés pour ensemencer 1L de bouillon BL, afin d’obtenir une culture de DO 595 nm égale à 0,1 (1/42,5è). Cette absorbance a été suivie au cours du temps jusqu’à obtenir une valeur de 0,6, correspondant à la phase exponentielle de croissance des bactéries (cf. Annexe II).

* Induction ± de l’expression de la protéine de fusion par l’IPTG 100 mM :

L’expression de la protéine de fusion GST-IDH est sous le contrôle du promoteur de l’opéron Lactose, Ptac , inductible à l’IPTG. En absence d’IPTG, la synthèse du répresseur transcriptionnel Lac I neutralise l’activité du promoteur Lactose en se fixant sur celui-ci. Si présent, l’IPTG se fixe au répresseur Lac I, empêchant ce dernier d’inactiver le promoteur Lactose ; il y a transcription des gènes qui sont sous son contrôle ( [ Figure 2 ]).

Figure 2: Mécanisme de l'induction à l'IPTG du promoteur Lactose.

L’expression de la protéine de fusion est induite par injection d’IPTG 100 mM dans une partie de la culture.