Tp volume sanguin

TP n°2 : Détermination du volume sanguin chez le rat

JAHID Sonia et FERNANDEZ Mélanie

Introduction

Le sang est un tissu liquide qui circule dans notre corps grâce aux vaisseaux sanguins.

Il est composé de globules rouges, de globule blancs et de plaquettes qui baignent dans un liquide appelé plasma. Le plasma est composé à 90% d’eau, il contient une grande variété de solutés et de protéines. Le sang joue un rôle essentiel dans le transport de l’oxygène, des nutriments, des anticorps et des hormones.

Il permet également de diffuser le dioxyde de carbone et les déchets azotés vers les sites d’évacuations.

L’objectif de ce TP est de déterminer le volume sanguin total chez le rat. Pour cela, une quantité connue d’un traceur, le Bleu Evans, va être injecté dans la circulation sanguine de l’animal.

A partir du volume plasmatique et après avoir mesuré le taux d’hématocrite nous évaluerons le volume sanguin total. Le taux d’hématocrite correspond au volume occupé par les globules rouges par rapport à la quantité du sang total.

1. Matériel et méthode

1. Manipulations expérimentales

• Préparation du rat.

La mesure du volume sanguin s’effectue sur un rat  anesthésié à l’uréthane à 5%. Puis l’animal est pesé afin de pouvoir déterminer la quantité de traceur à injecter. On note le poids : 347g.

• Pose d’une canule dans la veine jugulaire.

Cette technique opératoire vue précédemment a permis d’injecter le Bleu Evans dans la circulation sanguine.

• Pose d’un cathéter dans l’artère carotide.  

C’est une manipulation qui permet de recueillir le plus de sang possible dans un tube à hémolyse.

• Injection du traceur.

Le choix du traceur est important, il faut qu’il ait plusieurs propriétés indispensables :

       -      Non toxique

• Pas de métabolisme (aucune interaction avec les éléments figurés)
• Répartition de façon homogène dans le compartiment sanguin
• Pas de diffusion hors du compartiment sanguin
• PH neutre

Le Bleu Evans rempli bien toutes ces propriétés, c’est un traceur inerte qui est transporté par l’albumine.

Le volume du bleu Evans à injecter est déterminé à partir d’une solution mère dont la concentration est de 0 ,025 g / 100 ml et sachant que la dose sera de 0.05mg de produit pour 100 g de poids vif d’animal.

Notre animal pèse 347g, la quantité de Bleu Evans à administrer est donc : (0.05 × 347)/100 = 0.1735 mg. Notre traceur est sous forme liquide dans la solution mère, on injecte donc (0.1735mg × 1 mL)/0.25mg = 0.694 mL.

Une fois ce volume calculé, on l’a injecté par la canule placée dans la veine jugulaire.  Afin d’administrer tout le traceur dans la circulation sanguine, on a lavé la canule avec 0,2 ml de sérum physiologique.

• Prélèvement de sang

Il a fallu attendre 5 min pour que le Bleu Evans soit dilué de façon uniforme dans le sang. Le prélèvement du sang s’est effectué par l’intermédiaire du cathéter placé dans la carotide. On a coupé l’extrémité du cathéter et desserré la pince de Mohr, ce qui a fait couler le sang. On a recueilli un maximum de sang dans un tube à hémolyse préalablement hépariné afin d’éviter la coagulation. En attendant de centrifuger notre tube, il est conservé dans un bac à glace.

• Centrifugation du tube

Le tube a été centrifugé pendant 20 min à 4000 tours par minute. Après centrifugation on a observé 3 phases bien distinctes (plasma, globules blancs, éléments figurés).

• Calcul de l’hématocrite

Volume d’un cylindre = π × r² × h

Taux d’hématocrite =  × 100[pic 1]

Après simplification : [pic 2]

Taux d’hématocrite =    × 100        [pic 3]

1. Mesure photocolorimétrique

• Détermination du lambda max

On a préparé 40 ml d’une solution A : 2 ml de solution mère de Bleu Evans diluée dans 38 ml de sérum physiologique.

A la suite on a rempli la cuve de colorimétrie avec cette solution A, on l’a placé dans le spectrophotomètre. On a calculé l’absorbance en faisant varier le lambda de 500 à 700nm.                                                

On a tracé une courbe et trouvé un lambda max de 630 nm, voir tableau 1 et annexe 1.                                Cette valeur a permis de fixer la longueur d’onde afin de mesurer l’absorbance des différentes concentrations pour établir notre courbe étalon.

• Tracé de la courbe étalon

A partir de la solution A, on a effectué 5 dilution au 1/20 :

[pic 4]

- tube 1 : 2 ml de solution A + 8 ml de sérum physiologique

- tube 2 : 4 ml de solution A + 6 ml de sérum physiologique

- tube 3 : 6 ml de solution A + 4 ml de sérum physiologique

- tube4 : 8 ml de solution A + 2 ml de sérum physiologique

- tube5 : 10 ml de solution A

La densité optique de chaque solution a été mesuré à une longueur de 630 nm, voir tableau 2.

A la suite, on a pu tracer la courbe d’étalonnage, voir annexe 2.

• Mesure de la D.O du plasma dilué

Dans une cuve de colorimétrie nous avons ajouté 1 ml de plasma dans le tube centrifugé précédemment et 1 ml de serum physiologique.  Ici on a effectué une dilution au ½ pour être dans la phase ascendante de la courbe d’étalonnage et non dans la zone saturante ce qui aurait faussé nos résultats.

Ensuite on a mesuré l’absorbance, précisant que le 0 a été mesuré avec une cuve de sérum physiologique.

• Calcul du volume plasmatique (Vp) et du volume sanguin total (VTS)

VTS = volume sanguin total

Vef = Volume des éléments figurés

VTS = Vp + Vef

Vp = VTS – VEF

Vp = [pic 6][pic 5]

Vp = 1 - [pic 8][pic 9][pic 7]

On en déduit le volume sanguin total :

VST = [pic 10]

1. Résultats

• Calcul du Taux d’hématocrite

Après centrifugation on a obtenu 3 phases :

[pic 11]

Nous appliquons ici la formule démontrée précédemment (partie matériel et méthode).[pic 12]

Taux d’hématocrite =    × 100        [pic 13]

On trouve H = 6.5 cm et h = 4.2 cm

Taux d’hématocrite =  × 100 = 64.61 %[pic 14]

• Détermination du lambda max

Ce tableau nous a permis de tracer la courbe (voir annexe 1).

• Tracé de la courbe étalon

Tableau de résultat des densités optiques des différentes dilutions du Bleu Evans :

Voir courbe d’étalonnage annexe 2.

• Calcul du volume plasmatique

En mesurant la densité optique de la cuve remplie de 1 ml de plasma et 1 ml de sérum physiologique on a trouvé 0.688.