Compte-rendu TP analyses sanguines

COMPTOUR Perrine                                                                                                                       Groupe TP.6

POIREAU Margaux

TP 2 : DETERMINATION DU VOLUME SANGUIN CHEZ LE RAT

I- Introduction

Le but de notre TP est de déterminer le volume sanguin chez le rat. Nous avons donc déterminé le volume plasmatique et l'hématocrite, afin d’en déduire le volume sanguin total. Le plasma est l'élément liquide du sang, c'est le liquide dans lequel les éléments figurés et différentes cellules sont en suspension. L'hématocrite correspond à la quantité d'éléments figurés dans le volume sanguin total.

Pour effectuer nos mesures, nous avons utilisé le Bleu Evans, colorant qui se lie aux protéines plasmatiques, puis réalisé un prélèvement de sang chez l'animal.

II- Matériel et Méthodes

Nous avons utilisé un rat de la souche WISTAR, d'un poids de 302 grammes. Il a préalablement subit une anesthésie par injection en intra-péritonéale d'uréthane à 5%. Le contrôle de l'anesthésie a été effectué par examen des réflexes du rat suite à différentes stimulations. Une seconde injection d'uréthane a été nécessaire car des réactions du rat on été observées.

L'animal a été fixé sur une planche et manipulé sous une lampe pour prévenir les risques d'hypothermie.  

La mesure du volume sanguin chez le rat nécessite un prélèvement sanguin ainsi que l'injection d'un colorant qui se fixe aux protéines plasmatiques. Pour cela, nous avons effectué une canulation de la veine jugulaire et posé un cathéter dans la carotide de l'animal.

        Pose de la canule dans la veine jugulaire :

Nous avons donc disséqué la veine jugulaire 2cm en dessous de la bifurcation céphalique. Nous avons passé un premier fil au dessous de cette bifurcation et un second du côté des muscles sterno-cléido-mastoïdiens. Nous avons ensuite incisé la veine, introduit la canule et effectué les ligatures.

Cette technique opératoire a été effectuée sans problèmes notoires, c'est grâce à cette canule que avons réalisé l'injection de colorant.

        Pose du cathéter dans l'artère carotide :

Nous avons dégagé la trachée en écartant les muscles environnants puis, après avoir localisé l'artère carotide d'apparence rose et pulsée, nous l'avons isolée puis ligaturée du côté céphalique. Nous avons ensuite posé un clamp pour bloquer la circulation, incisé la paroi de l'artère, inséré le cathéter (préalablement taillé en collerette) puis effectué la première ligature ainsi qu'une autre pour tenir en place le cathéter.

Nous avons eu des difficultés pour poser le cathéter dans l'artère carotide, celle-ci ayant été trop largement entaillée. Nous avons donc réitéré plusieurs fois l'expérience avant de réussir à immobiliser le cathéter.

        Injection du colorant bleu Evans :

Le bleu Evans est un colorant inerte, non toxique. Il se lie aux protéines plasmatiques et ne pénètre donc pas dans les cellules sanguines afin de se répartir dans la circulation de manière homogène.

La solution mère à injecter contient 0,025% de bleu Evans.

Lors de l'injection, nous nous sommes rendues compte que la canule avait mal été posée dans la veine jugulaire. En effet, nous ne l'avions pas assez enfoncée, et quand nous avons injecté le colorant il s'est dispersé hors de la veine. Nous avons donc re-posé la canule dans la veine jugulaire puis nous avons réinjecté une autre dose de colorant bleu Evans.

        Prélèvement de sang :

Le prélèvement de sang devait être effectué 4 minutes 30 après l'injection.

Comme nous avons rencontré des difficultés avec l'injection du colorant nous n'avons pas pu respecter exactement cette durée.

Nous avons cependant commencé le prélèvement de sang en ouvrant le clampe qui maintenait fermé l’artère, pendant le prélèvement le cathéter s'est enlevé de l'artère carotide.  Nous avons finalement recueilli approximativement 3 mL de sang dans un tube à hémolyse hépariné.

        Les tubes ont ensuite été conservés dans la glace puis centrifugés à 4000 tours/minute pendant 10 minutes.

        Mesure photo-colorimétrique et courbe étalon :

A partir de la solution mère de bleu Evans utilisée précédemment (concentration a 0,025% de bleu Evans), nous avons réalisé une dilution au 1/10ème soit 4 mL de colorant bleu Evans dilué dans 36 mL de sérum physiologique. C'est la solution A à partir de laquelle nous avons réalisé des dilutions selon les concentrations suivantes.

Nous avons ensuite mesuré l’absorbance de ces différentes dilutions, en prenant pour zéro une cuve de sérum physiologique, afin de réaliser une courbe d’étalonnage. L'intérêt de cette gamme étalon est de pouvoir tracer une courbe étalon qui nous a permis par la suite de déterminer la concentration en bleu Evans du plasma recueilli.

III- Résultats

        Calcul du volume de Bleu Evans à injecter au rat :

La solution mère à injecter contient 0,025% de bleu Evans.

Il faut injecter 0,05mg de colorant / 100 g de poids vif, sachant que notre rat à un poids de 302 g :

(0,05 x 302) / 100 = 0,151 mg de colorant.

Donc :

(0,151 x 1) / 0,25  = 0,604 mL

Nous avons donc injecté 0,604 mL de solution mère au rat a l’aide de la canule dans la veine jugulaire.

        Courbe étalon :

Tableau des absorbances mesuré pour les échantillons de la gamme étalon :

Grâce a ces mesures nous avons établit la courbe étalon suivante :

[pic 1]

Calcul du volume sanguin total :

Afin de connaître le volume sanguin total du rat, il était donc nécessaire de déterminer la concentration de traceur (colorant) dans le plasma et l'hématocrite, afin d'ensuite déterminer le volume du plasma et le volume total sanguin.

Nous avons aussi mesuré la longueur d'onde du plasma recueilli par prélèvement d'1mL de plasma dilué dans 1mL de sérum dans une cuve (dilution a ½) : mesure de 0,137 nm.

Soit dans notre tube à hémolyse l'échantillon de sang était divisé après centrifugation :

le culot rouge et l'interface blanchâtre constituent les éléments figurés et la partie supérieure contient le plasma.

Pour connaître le volume sanguin total, nous avons utilisé la formule :

                             Volume de sang total VST = V(plasma) + V(éléments figurés)

Pour trouver le volume d'éléments figurés il était nécessaire de déterminer l'hématocrite, qui s'exprime en pourcentage. Elle se mesure directement sur le tube à hémolyse (c'est la proportion d'éléments figurés rapportée au volume total du sang recueilli).