TD de biologie cellulaire

TD Biologie cellulaire 

essaye de mettre les images et faire le schéma ok !!! ;)

Exercice n°1

1.Figure 1:

[pic 1]

• But : Comprendre le rôle de Aurora A et B dans l'alignement des chromosomes, le le fonctionnement du kinétochore, dans l’alignement des chromosomes à la métaphase.

Image A : 

• But : Il s’agit d’une manipulation centrale pour vérifier que Aurora A et B sont bien absentes quand il y a transfection de SiRNA contre ces 2 protéines.

SiRNA inhibe l’expression d’une protéine en se fixant sur un ARN aurora A de manière spécifique : soit on bloque la traduction, soit cela entraîne la dégradation de l’ADN.⟶ Dans les 2 cas, on arrive à inhiber la production de la protéine. Les chercheurs ont fait des transfections de siRNA dans des cellules synchronisée en G1/S et plus précisément dans  des cellules Hela.

Rappel : Aurora A et B sont des kinases ancrées dans les parties interne du kinétochore, elle servent de contrôle pour savoir si l’attachement est correcte. Une faible tension est la preuve d’un mauvais attachement et Aurora B va phosphoryler le complexe NDC( ⇒ pont entre le kinétochore et les microtubules). Lorsque la tension est correcte Aurora B ne phosphoryle pas NDC.

• Technique : Western blot analyse des protéines
• Matériel:

• Cellules HeLa: cellule cancéreuses bloquées/synchronisée en transition G1/S, elle sont ensuite transfectée (= faire rentrer à l’intérieur des cellules les ARN interférant), puis débloquées et 7h après on peut les observer, ensuite on a extrait les protéines
• Anticorps Aurora-A, Aurora-B, tubulin

• Témoins utilisés:

• Témoin WB: alpha tubulin (impliquée dans les microtubules) → témoin de quantité de protéines déposées par puit. L’alpha tubuline est une protéine de ménage qui contrôle la quantité de protéines déposées (house keeping). Elle est exprimée au même niveau dans chaque type cellulaire,

Les quantités déposées sont équivalentes⇒ on va pouvoir comparer les autres quantités de protéines.

• Piste contrôle: SiARN non spécifique d’aucune lignée cellulaire → vérifier si la transfection ne provoque pas l’expression d’Aurora-A et Aurora-B ⇒ témoin de la transfection  

• Description résultats observés:

• Dans : pour le contrôle on a bien Aurora A et Aurora B
• Avec siRNA anti Aurora-A: inhibition d’Aurora-A mais pas d’Aurora-B donc le siRNA est bien spécifique.
• Avec siRNA anti Aurora-B: très peu d’expression de Aurora-B et ne perturbe pas l’expression de Aurora-B

• Conclusion: On sait qu’on est capable d’inhiber chacune des molécules et spécifiquement.

Figure B:

• But: Cherche à voir l’alignement des chromosomes en métaphase sur la plaque équatoriale en absence d’Aurora-A ou Aurora-B.
• Technique: immunofluorescence (=IF) avec présence d’anticorps couplé à un fluorochrome (émet de la lumière à une longueur d’onde particulière: DAPI (intercalant de l’ADN, bleu) et FITC (vert)).

[pic 2]

• Matériel: Ici on observe les cellules dans leur forme complète, et plus précisément l’alignement des chromosomes en absence d’Aurora-A ou Aurora-B. Comme l’alignement des chromosomes se fait entre la tubuline et le kinétochore, la tubuline va servir à voir si l’attachement est bien fait.
• Témoins utilisés: contrôle ARNsi
• Description :

• Pour le contrôle: il y a un bon alignement des chromosomes en DAPI, pour la tubuline on observe bien les deux fuseaux. Et quand on regarde le Merge, les µtubules et les chromosomes sont bien positionnés les uns par rapport aux autres ⇒ bien reliés  
• Pour le cas b, aurora A est inhibé par les ARNsi: pour le DAPI, les chromosomes ne sont pas très bien alignés, la tubuline semble plus diffuse, les 2 faisceaux ne semble pas bien positionnés. Pour le Merge on remarque que l’alignement et l’attachement des chromosomes sont presque correct .
• En condition c, les chromosomes sont encore moins bien alignés, la tubuline est resserrée on voit moins bien le pôle et les extérieurs. En Merge on remarque une aberration de l’alignement et de l’attachement

Conclusion : L’absence d’Aurora A et B bloque en partie l’alignement des chromosomes en métaphase et perturbe la formation des faisceaux de µtubules.

Figure C:

• But : quantification des expérience de B sur une centaine de métaphase
• Technique: Immunofluorescence
• Témoin :
• Description : Pour le témoin, le pourcentage de mauvais alignement des chromosomes est de 2.5%. En l’absence de Aurora-A, 50% de mauvais alignement, Sans Aurora-B 30% de mauvais alignement. Confirme que Aurora A et B ont un rôle dans l’alignement et l’attachement des chromosomes mais Aurora-A semble avoir un impact plus important.

⇒ Bien penser à tout regarder et comprendre comment est fait la manipulation

2. Figure A:

[pic 3]

• But: Corrélation entre la présence ou l'absence de ces protéines et la phosphorylation de CENP-A en prophase et en prométaphase
• Technique: Immunofluorescence sur cellules, on  a regardé
• Matériel:

• cellules HeLa: cellule cancéreuses bloquées à la transition G1/S, elle sont ensuite débloquées et 8,5h après on peut les observer. Elles sont transfectées.
• Ac anti S7P de CENP-A : couplé avec FITC ⇒ vert
• Ac anti cyclinB1: couplé avec texas red ⇒ rouge. La cycline B1 est spécifique de la mitose, sa morphologie en prophase précoce se retrouve au niveau du cytoplasme. En fin de prophase se retrouve dans le noyau et en prométaphase est toujours dans le noyau mais sans enveloppe
• DAPI⇒  Bleu. Permet de suivre le noyau

• Description:

• Dans le contrôle CENP-A: il y a une phosphorylation de CENP-A progressive qui s’intensifie lors de la prophase. On les retrouve au niveau du noyau et plus précisément CENP-A remplace H3 dans les nucléosomes centromères. Donc on localise les centromères (chaque point vert est un centromère)
• En absence d’Aurora-A: très peu de phosphorylation de CENP-A par rapport au contrôle.
• En absence d’Aurora-B: phosphorylation de CENPA-A en phase précoce mais disparition au fur et à mesure

• Conclusion : Aurora-A et Aurora-B sont indispensables à la phosphorylation de la sérine 7 de CENP-A au cours le prophase et au début de la métaphase. En début de prophase Aurora-A est responsable de la phosphorylation de la sérine 7 CENP-A.

Penser à conclure avec le but poser en début d’exercice et continuer sur les précisions

Figure B:[pic 4]

• Ils ont  quantifié le nombre de cellules positives au cours de la prophase de la Sérine.
• Ces deux protéines sont indispensables à la phosphorylation de la Sérine 7 avec en début de prophase, Aurora-A débute la phosphorylation.

3. But de la figure 6: