Compte rendu de biotechnologie vegetale et animale

helper 10-2 | 0 | | |

Donneuse, receveuse 10-2 | 0 | | |

Témoin positif 10-4 | 953 | | |

Prèmierement, nous observons que pour les cultures contenantes seulement les souches donneuse et receveuse ou seulement donneuse et helper incubées sur le milieu LB-GK aucune colonie apparaît. Pour les cultures des trois souches, placées sur le milieu LB-GK les nombres de colonie baisse d’environ facteur 10 avec la concentration dimunuante de même facteur. L’efficacité calculée par rapport au nombre de colonies sur le milieu LB-G pour les concentration 10-4 et 10-3 est égale respectivement à 2.3% et 4.8%. Nombre de colonies bacteriennes pour le temoin positif est d’environ 4 fois superieur que le nombre de bacteries obteniu par la conjugaison triparentale effectueé au cours de cette experience.

3. Interprétations et conclusions

L’absence de bacteries sur les boîtes contenantes mélange de seulement deux souches bacteriennes suggére que la conjugaison triparentale n’est pas possible que en presence des tous les trois partenaires - bacteries donneuses, receveuses et helper. Le transfert de l’ADN ne se produit pas si on incube ensemble seulement les souches donneuses et receveuse. Aucun transfert n’est pas observé aussi entre la souches helper et receveuse.

La difference dans le nombre de bacteries pour le témoin (10-4) et culture de donneuses, receveuses et helpers (10-4) découle du fait que les bacteries témoins sont dans une phase differente de la croissance bacterienne. Le temps d’incubation pour les deux cultures n’était pas égal alors les bacteries « D+H+R » n’ont pas atteint le même niveau de la croissance.

L’efficacité de conjugaison triparentale égale à 2.3% et 4.8% indique que ce processus permet une introduction d’ADN dans les bacteries beaucoup plus efficace que les autres methodes connus (électroporation, choc thermique). Ainsi cette technique peut aider à surmonter certaines barrières pour une transformation bacterienne productive. La difference entre 2 valeurs d’efficacité résulte de fait que elles sont calculées à partir de deux concetrations differentes. Alors, on peut assumer que le résultat pour la culture 10-3 est plus exact car il est déterminer à partir d’un nombre de bacteries plus significant.

Test GUS

1. Introduction

Les agrobacteries contentant le plasmide pKY70GIN peuvent être ensuite utilisées pour la transformation d’une plante. L’A. tumenfaciens est un pathogène connu des plantes – il provoque une maladie appelée galle du collet (formation des tumeurs sur la plante infectée). L’infection est possible car un fragement d’ADN (ADN-T) du plasmide bacterien Ti est transféré dans la plante et ensuite integré dans ses chromosomes. Un plasmide modifié peut être utilisé aussi bien. Une de methodes d’agroinfection est la coculture – incubation de tissus végétals avec des agrobacteries. Puis, les cellules de plante sont mises en culture jusqu’a la formation du cals et ensuite la régénération de la plante entiere. La présence du transgène GUS-intron dans les plantes peut être visualiser par le test GUS. Le gène GUS code pour l’enzyme β-glucuronidase qui catalyse le clivage des glucuronides. Un des substrats de la β-glucuronidase est le X-Gluc qui est un de constituents de la solution GUS. L’activité de la β-gluc entraîne libération du 5-bromo-4-chloro-3-hydroxyindole, qui, dans les conditions crées par les autres comosentss de la solution GUS, dimerise formant un complexe bleu.

Le but de cette experience est de tester deux plantes pour la présence du transgène en utilisant le test GUS. Un morceau de feuille de chaque plante est préparer et lacérez et ensuite immergé dans la solution GUS. Après une nuit d’incubation la coloration de feuilles est determinée. Pour faciliter l’observation les tissus sont décolorés avec de l’éthanol.

2. Résultats

Deux plantes testées sont dénotées comme la « rouge » et la « noire ».

Feuille de la plante « rouge » | bleu |

Feuille de la plante « noire » | transparant |

Résultats d’observation montre une coloration bleu sur le tissu de la plante rouge. Aucune coloration est observée pour la plante noire.

3. Interprétations et conclusions

Les résultats obtenus montrent que la plante rouge est trangènique. La deuxième plante testée, la noire, ne possede pas de transgène ou il n’est pas exprimé.

Induction

1. Introduction

Cette experience est sacrifiée à l’étude l’induction d’expression bacterienne. La protéine p53 est produite par E. Coli sous forme d’une fusion avec la GST (Glutathion S Transférase). Fragment de l’ADN codant pour la protéine de fusion se trouve sous contrôle du promoteur Ptac. L'expression de gènes en amont de ce promoteur est réprimée par la protéine LacI. L’ajout de l'inductuer comme IPTG inactive le répresseur LacI. Ainsi, le taux d'expression de Ptac est proportionnel à la concentration d'IPTG ajouté (les concentrations basses résulte en l'expression relativement basse et les concentrations aboutissantes à la expression élevée). Les autres facteurs qui influencent l’induction de l’expression des gènes sous contrôle du Ptac sont :

* durée d’induction ;

* temperature d’induction ;

* souche bacterienne utilisée ;

* milieu sur lequel les bacteries sont cultivées ;

Pendant l’experience nous voulons déterminer les conditions optimales pour l’induction d’expression du promoteur tac. Nous jouons sur deux facteurs : l’intensité d’induction (la quantité d’inducteur ajoutée) et sa durée. Dans 4 tubes differents concentration d’IPTG ou differentes periode d’induction son testées. Le tube 1, ne contient pas d’IPTG – elle sert comme contrôle negatif. Nous disposons aussi de le tube 5 qui est le contrôle positif possedent le vecteur pGEX qui code pour la protéine GST. Le niveau d’expression est determiner indirectement – on mesure la densité optique d’echantillon, alors la quantité de bacteries presentes. Les echantillons sont aussi deposées sur le SDS-polyacrylamide, qui separe les protèines en fonction de leur masse.

2. Résultats

Differentes condition testées donne les résultats montrés dans le tableau.

Clone | N0 | Concentration d’IPTG [mM] | Temps d’induction (h) | Absorbance600 |

GST-p53 | 1 | 0 | 2 | 0.453 |

| 2 | 0.2 | 1 | 0.275 |

| 3 | | 2 | 0.404 |

| 4 | 2 | 2 | 0.404 |

GST | 5 | | 2 | 0.319 |

Toutes les absorbances se placent entre 0.275 et 0.453 unités arbitraires. Les conditions d’incubation de bacteries ont été differantes. Pour le tube 1, nous n’avouns pas ajouté d'IPTG (seulement du glucose pour inhiber l’éxpression du Ptac) et et nous avons l’incubée pendant 2 heures. L'absorbance mesurée est égale à 0.453, qui est la valeur la plus grande de tous le mesures. Pour les tubes 2 contenant 0.2 mM d'IPTG, et le temps d'incubation d’une heure, nous obtenons l'absorbance de 0.275. Pour deux tubes, 3 et 4, l’absorbance est égale malgré concentration la concentration d'IPTG variable (de 0.2 et 2 mM). Pour le contrôle positif, le tube 5, la densité optique est égale à 0.319.

Afin de pouvoir comparer nos résultats, nous avons calculé le volume de suspension correspondant à la valeur de l'absorbance de 0.5. Les valeurs obtenues sont présentées dans le tableau ci-dessous.

Tube | Absorbance600 | Volume correspondant à l'absorbance 0.5 [ml] |

1 | 0.453 | 0.110 |

2 | 0.275 | 0.182 |

3 | 0.404 | 0.124 |

4 | 0.404 | 0.124 |

5 | 0.319 | 0.157 |

Inversement, nous pouvons observer que le volume le plus petit (0.110 ml) correspond à le tube 1 et le plus significant (0.182 ml) pour le tube 2. Les valeurs pour les tubes 3 et 4 restent égaux (0.124 ml). Le volume exigé pour témoin positif (tube 5) est plus important que pour le témoin negatif qui indique l’influence de la production des protèines sur la croissance bacterienne.

Les résultats du gel SDS-polyacrylamide (voir annexe), montren que, pour tous les échantillons testées il y a plusieurs bandes fines aux hauters differentes. Pour l’échantillon du tube 1 ce sont les seules bandes observées. Sur les pistes 2, 3 et 4 nous voyons une bande épaisse à la même hauter, mais la épaisseur sur la 2 est moins important que sur les deux autres. Pour l’échatillon du tube 5 sur le gel il y a une bande épaisse, mais elle se trouve plus bas que les bandes sur les pistes 2, 3 et 4.