Détermination du volume sanguin chez le rat.

Sarah

Le 28/09/17

TP n°2 : Détermination du volume sanguin chez le rat

1. Objectif du TP

1. But

Déterminer le volume sanguin chez le rat en fonction de son poid.

1. Principe

1. Injecter un traceur, le Bleu Evans, dans l’appareil circulatoire de l’animal à travers une canule.
2. Réaliser un prélèvement sanguin afin de mesurer la concentration de ce traceur dans 1 ml du plasma.
3. Effectuer le dosage photocolorimétrique du Bleu Evans et déduire une gamme étalon.

Le Volume Sanguin est constitué de deux parties, l’hématocrite et le volume plasmatique :

• L’hématocrite est la proportion d’éléments figurées qui se trouve dans le sang total (que l’on notera H).
• Le volume plasmatique est la partie liquide du sang dans lequel les cellules et les éléments figurés sont en suspension (on le notera VP).

En déterminant de façon expérimentale le pourcentage d’hématocrite ainsi que le volume plasmatique, on peut déduire le volume de sang total.

1. Présentation du TP

1. Manipulations expérimentales

Premièrement, peser le rat préalablement anesthésié. Puis, fixer l’animal sur le dos à l’aide de lacets (le noué aux membres inférieur et supérieure à la lumière).

1. Mettre une canule dans la veine jugulaire

Cette opération permet d’injecter une substance dans l’organisme, ici le Bleu Evans.

• Faire une ouverture franche et précise dans la région du cou (1cm ou 2cm).
• Écarter les glandes salivaires et les muscles : la veine jugulaire se trouve en périphérie.
• Désolidariser la veine des tissus et isoler la partie de la veine qui nous intéresse.
• Faire un noeuds (L1) à l'extrémité céphalique pour couper la circulation.
• Faire une incision dans la veine.
• Rentrer la canule puis faire deux autres attaches L2 et L3 au dessus de “l’olive” pour bien maintenir la canule et la veine.

1. Mettre un cathéter dans l’artère carotide

Cette opération permet d’effectuer le prélèvement sanguin.

On utilisera le même champ opératoir. L’artère se trouve en profondeur près de la trachée.

• Écarter les muscles et les glandes salivaires.
• Remonter la veine à la surface et retirer les nerfs.
• Prendre un cathéter, le couper en biseaux et le brûler légèrement de l’autre côté.
• Faire une attache L1 à l'extrémitée encéphalique, et mettre le clampe à l’extrémité cardiaque (le plus bas que possible).
• Faire une incision, insérer le cathéter et faire deux autres attaches L2 et L3 pour bien maintenir le cathéter.

1. Injecter le Bleu Evans dans la circulation

Le Bleu Evans est choisie car c’est une molécule inerte, facile à doser, non toxique. Il ne participe pas aux réactions métaboliques chez l’animal, et il est limité à une diffusion dans la circulation (que dans l’espace vascularisé). Sa destruction, son élimination, sa diffusion et son excrétion est assez lente. Il se fixe sur des protéines, notamment l’albumine.

• Prélever la quantité nécessaire de Bleu Evans (QBE) à l’aide d’une seringue. Attention ! Prélever 0,1 mL en plus, afin d’anticiper les risques de fuite de Bleu Evans.
• Injecter QBE dans la canule.
• Injecter rapidement 0,3 mL de sérum physiologique pour être sur que la quantité totale du traceur soit bien injecter dans le sang.
• Attendre 4min15 : temps nécessaire pour que le Bleu Evans pénètre dans la circulation totalement (hypothèse).

1. Prélèvement d’un échantillon de sang

• Préparer  le tube à hémolyse avec quelque gouttes d’héparine, et tarer à 4 ml. L’héparine est utilisé ici afin d’éviter la coagulation (élimine le calcium).
• A la fin du temps imparti (4min15), faire rapidement le prélèvement : couper le cathéter, retirer le clampe et prélever le sang jusqu’au trait de 4ml.

1. Centrifugation

• Boucher le tube à hémolyse avec le doigt et retourner le tube deux fois
• Centrifuger pendant 10 min à 4000 tours/min.
• Pendant la centrifugation, tuer l’animal en insérant de l’aire dans la veine jugulaire, à l’aide d’une seringue.

Après la centrifugation, on obtient deux phases :

• Le surnageant qui correspond au plasma
• Le culot qui correspond aux éléments figurés

1. Calcul de l’hématocrite

• Mesurer le volume des éléments figurés (Vef) ainsi que le volume total du tube (Vsgt). Cela permettre de calculer la quantité d’hématocrite (Ht).

     B. Mesure photocolorimétrique

1. Tracé de la courbe étalon

• Faire la solution A à partir de la solution mère de Bleu Evans (4 mL de BE pour 36 mL de sérum physiologique).
• Faire les dilutions suivantes à partir de la solution A :

• Mesurer leur D.O à 580 nm afin de tracer la courbe étalon.

1. Mesure de la D.O du plasma dilué

• Prélever 1 mL de plasma.
• Ajouter 1 mL de sérum physiologique.
• Mesurer la D.O à 580 nm.

III. Résultats

Poid du rat (Prat) = 291 g

Lexique :

QBE = Quantité de Bleu Evans (en mL)

Vef = Volume des éléments figurés (en cm)

Vsgt = Volume total du tube à hémolyse contenant surnageant + éléments figurés (en cm)

Ht = Quantité d’hématocrite (en %)

a = Quantité de Bleu Evans (en mg)

x = Concentration du Bleu Evans dans le plasma de lapin dilué (en mg/mL)

b = Concentration du Bleu Evans dans le plasma de lapin (en mg/mL)

Vp = Volume plasmatique (en mL)

Vt = Volume du sang total (en mL)

VT = Volume total de sang (en %)

1. Calcule de QBE 

Solution mère du Bleu Evans :

• Quantité de 0,05 mg / 100 g du poid

        → Donc a = = = 0,1455 mg[pic 1][pic 2]

• Concentration de la solution mère de Bleu Evans est 25 mg / 100 mL

        → Donc QBE = = = 0,582 mL soit 0,6 mL[pic 3][pic 4]

1. Calcule de Ht

Vef = 2,5 cm  et  Vsgt= 5,11 cm

→ Donc Ht = =  = 49 %[pic 5][pic 6]

1. Tracé de la courbe étalon + D.O du plasma dilué

Titre : Tableau de résultat des densité optiques pour la courbe étalon