Dysfonctionnement photosynthétique et stress oxydatif chez les végétaux : Sources, effets et protection

[pic 1]

I. Introduction

L’accroissement et la diversité des activités humaines s’accompagnent d’une dispersion de quantité, parfois énorme, de xénobiotiques nocifs. Au fil du temps l’accumulation des polluants conduit à la détérioration de la qualité de l’environnement comme par exemple au déclin des forets et à la diminution de la productivité agricole. C’est pour cela qu’il y a un grand intérêt  d’effectuer des études de toxicité pour identifier les altérations physiologiques induites par les polluants. En effet les polluants peuvent réduire la production de la biomasse végétale en inhibant la photosynthèse.

La photosynthèse est un processus physiologique primordial pour le métabolisme général de l’organisme végétal. Ce système est un ensemble de réactions permettant aux végétaux de convertir l’énergie lumineuse en énergie chimique, en dégageant de l’oxygène par l’oxydation de l’eau. Cette oxydation permet de réduire le dioxyde de carbone mais aussi la synthèse des glucides (Whitmarsh, et al.)

6 CO2 + 12 H20 + Énergie lumineuse → C6HI20 6 + 6 O2 + 6 H20 + Dissipation d'énergie sous forme de fluorescence et de chaleur

        Notre recherche consiste à étudier les mécanismes d'inhibition des réactions photochimiques  par deux herbicides montrant une toxicité. 

De nombreux herbicides, comme le diuron (DCMU), agissent en bloquant le flux d'électrons à des accepteurs de quinone du photosystème II, par compétition pour le site de liaison de plastoquinone. D'autres herbicides tels que le paraquat, agissent en acceptant des électrons à partir du début des accepteurs du photosystème I, puis la réaction avec l'oxygène pour former du superoxyde, une espèce qui est très dommageable pour les composants, en particulier des lipides chloroplastiques. Le superoxyde est un radical libre qui réagit de manière non spécifique avec une large gamme de molécules dans le chloroplaste, ce qui conduit à la perte rapide de l'activité du chloroplaste.

Nous allons comparer les résultats obtenus avec les témoins de lumière et ceux avec les plantes qui ont subie l’effet de l’herbicide (DCMU), pour ainsi d’étudier l’effet de la concentration d’herbicide. Et surtout comparer la quantité de MDA produit pour voir si la régulation du métabolisme de l’oxygène est perturbée ce qui déclenche des peroxydations lipidique en chaîne et donc la formation de produit non enzymatiques comme par exemple le MDA qui est l’un des principaux.

Nous déterminerons les effets sur les biomolécules (peroxydation lipidique) et la réponse enzymatique antioxydante (dosage de l’activité de deux enzymes impliquées dans la réponse antioxydante : les peroxydases et les superoxyde dismutases)

II. Matériels et méthodes

Matériel végétal

Nous utilisons de feuille de colza (Brassica napus) avec son pétiole, âgés d’environ 28jours. Le colza est une plante annuelle à fleurs jaunes de la famille des Brassicacées, elle est l’une des principales ressources d’huile végétale.

Traitement de feuilles de colza avec différents inhibiteurs de la photosynthèse

Chaque feuille est traitée avec 3mL d’herbicide : d’DCMU (3-(3,4-dichlorophényl)-1,1-diméthylurée et 3mL d’eau ultra pure pour les témoins. Chaque triplicata est exposé à la lumière pendant 60min. L’herbicide est tester a différentes concentration 10µM et 100µM. Suite à ce traitement, les limbes sont broyer à l’aide d’azote liquider.

Les échantillons sont réaliser de la manière suivante, les échantillons sont réaliser à la lumière :

- témoin non traités

- feuille + 10µM DCMU

- feuille + 100µM DCMU

Détermination des produits de peroxydation lipidique (TBARs-MDA)

La préparation des extraits végétaux est réalisée dans 1.8mL d’éthanol (80 :20 v/v), puis incuber 10min a température ambiante et centrifuger a 3000g pendant 10min, le surnageant sera utiliser comme extrait brut.

Le dosage des MDA est réalisé en duplicata, de la façon suivante ; 400µL d’extrait végétal avec 400µL de réactifs soit « +TBA », soit « -TBA ». En parallèle on réalise une gamme de MDA (0 ; 0,2 ; 0.4 ; 1 ; 2 ; 5 ; 10 ; 15 ; 20 µM de MDA) chaque concentration est faite en duplicata, un exemplaire « +TBA », le second « -TBA ».  Chaque échantillon est ensuite chauffer au bain marie 95°C, 25min puis refroidi dans la glace avant d’être centrifuger 10 000g, 5min. L’absorbance des surnageant est lue au spectrophotomètre à 532, 440 et 600 nm.

Préparation d’un extrait enzymatique et dosage des protéines

Les feuilles traitées et broyées sont mis en contact avec 1mL de tampon d’extraction (tampon phosphate de potassium 50mM, pH 7.5, EDTA 1mM, PVPP 5%, ascorbate 5mM, cocktail inhibiteur de protéases 0.5%) et laisser incuber 1 heure à 4°C sous agitation. Les surnageants obtenus grâce à la centrifugation, 12000g, 20min, 4°C, sont utilisées pour réaliser le dosage protéique.

On réalise un dosage protéique des extrait végétale grâce à la méthode de Bradford (Bradford, 1976) et à l’aide d’une gamme de BSA (0,5 ; 1 ; 1,5 ;2 ; 2,5 µg/µL).

Détermination de l’activité Gaïacol peroxydase (GPX)

Nous utilisons le gaïacol comme substrat donneur d’électrons pour doser les activités peroxydases. L’oxydation du substrat par l’enzyme est suivie grâce à la lecture de l’absorbance à 470nm, pendant 6min, avec une mesure toutes les 60secondes. Le milieu réactionnel est composé de tampon phosphate de potassium 100mM, pH6.5, gaïacol 15mM, H2O2 0.05%(16.2mM), extrait protéique. Les cuves de spectrophotométrique sont réalisées, en duplicata, de la façon suivante : H2O (670µL), tampon phosphate de potassium 10 X (100µL), gaïacol 10X (100µL), extrait enzymatique (30µL) et peroxyde d’hydrogène (100µL).

Détermination de l’activité Superoxyde dismutase (SOD)

L’activité SOD est mesurée grâce à la diminution de la formation du NBTred qui est suivie grâce à la lecture de l’absorbance à 560nm, pendant 8min.

Le milieu réactionnel est composé de tampon phosphate de potassium 50mM, pH7.8, EDTA 0.1mM, NBT 75µM, Méthionine 13mM, Riboflavine 2µM, extrait protéique. Les cuves de spectrophotométrique sont réalisées, en duplicata, de la façon suivante : H2O (750µL), tampon phosphate de potassium 10 X (100µL), NBT 10X (100µL), extrait enzymatique (10µL) et Riboflavine 10X (100µL).

Statistique

Toutes les expériences ont été réalisées en trois répétitions pour chaque échantillon (témoins et herbicide). Les données présentées ici sont les moyennes ± erreur standard des trois expériences indépendantes.

Gamme étalon de MDA

[pic 3]

Figure n°1 : Représentation graphique des MDA en fonction des concentrations théoriques attendues. Les points supérieurs à 10µM n’ont pas été pris en compte car or du domaine de linéarité.

Détermination des produits de peroxydation lipidique (TBARs-MDA)

Les équivalents MDA ont été calculés d’après (Hodges, et al., 1999)

[pic 4][pic 5]

Figure n°2 : Représentation graphique de la quantité en produits de peroxydation lipidique en nmol de MDA équivalant par gramme de matière fraiche (MF) dans nos essais et dans notre témoin. Les essais sont traités à différentes concentration en DMCU (10µM en orange et 100µM en vert) pendant 60min à la lumière. Les barres d’erreur représentent l’erreur standard, c’est-à-dire l’écart-type à la moyenne. Réalisés avec 2 réplicas.

MDA équivalent =  [pic 6]

III. Résultats

Nous avons étudié l’effet de la concentration (10 et 100 µM) en DCMU à la lumière. (Résultats du binôme 5 Eline et Roxane pour la concentration de 100µM)

Nous allons comparer ces résultats, cependant l’écart de concentration entre notre témoin de lumière et celui du binôme 5 est anormal. En effet nos deux témoins ont été traités dans les mêmes conditions, or nous pouvons constater des différences très importantes. Ainsi nous ne pourrons comparer les différences entre notre échantillon et celui de ce binôme mais seulement l’écart significatif entre notre témoin et notre échantillon ainsi que leur témoin et leur échantillon.