Enzymologie : Fractionnement subcellulaire TP biochimie

Merve KELESOGLU

Lucas ROUSSEL

Compte rendu TP1 & 2 de Biochimie:

Fractionnement subcellulaire

But :

Lors de ce TP nous avons utilisés la méthode de fractionnement subcellulaire qui est une méthode qui consiste à séparer les différents composants cellulaires par destruction de la membrane plasmique et par désorganisation de la cellule.

Principe :

A partir d’un homogénat de foie de rat, nous allons nous efforcer de rompre la membrane plasmique. Nous allons donc mettre les cellules en suspension dans un tampon STM et homogénéiser le tout ce qui nous permettra d’éclater les membranes de la cellule. On obtient un mélange contenant tous les organites de la cellule dans le tampon STM.

Grâce à plusieurs centrifugations, on va isoler les différentes fractions : noyau, mitochondries, microsomes et ribosomes. A partir de ces fractions, nous allons mesurer l’activité́ glucose-6-phosphatase par la méthode de Fiske et Subbarow, pour pouvoir doser la quantité́ de phosphore dans ces fractions. Une mesure de l’activité́ cytochrome C oxydase est réalisée aussi dans le but de suivre la ré-oxydation du cytochrome C réduit, par spectrométrie.

Nous avons a étudié la fraction microsomes. Son volume total est de 2,4 mL.

En annexe 1 on pourra retrouver le tableau des résultats bruts des manipulations pour chaque fraction que l’on étudie.

I – Dosage des protéines de la fraction

Dans le but déterminer la concentration en protéines de la fraction de microsome, on effectue une gamme étalon de BSA :

[pic 1]

Y=0,00907x-0,001

1er dosage : 100 µL de la fraction dilué au 1/2.

[pic 2]

Ici, x représente la concentration de protéine dans la fraction.

[pic 3]

Un produit en croix nous permet de ramener la concentration par mL.

[pic 4]

[pic 5]

Nous obtenons alors 6,6 mg/mL de protéines.

En rapportant cela aux 2,4 mL de la fraction, nous obtenons la quantité totale de protéine :

[pic 6]

2nd dosage : 200 µL de fraction dilués au demi.

[pic 7]

[pic 8]

[pic 9]

Nous obtenons alors 5,7 mg/mL de protéines.

En rapportant cela aux 6 mL de la fraction, nous obtenons la quantité totale de protéine :

[pic 10]

La moyenne de ces deux dosages nous permet de conclure sur les concentrations :

[pic 11]

[pic 12]

II – Mesure de l’activité glucose-6-phosphatase dans la fraction

• d'où vient cette masse de phosphore (sous forme de phosphate) qui apparait dans le milieu de réaction ?

Cette masse de phosphore qui apparait dans le milieu de réaction vient de la dégradation du glucose-6-phosphate qui est dégradé en glucose + Pi par l’enzyme.

• sait-on convertir une masse de phosphore en mole de phosphore ?

On détermine la masse de phosphore présente dans la prise d’essai grâce à une gamme étalon que l’on divise par la Masse molaire du phosphore.

[pic 13]

Voici les absorbances à 700 nm obtenues :

L’équation de la courbe de tendance linéaire est :

Y=0,1311x-0,001

Pour notre gamme la pente est de 0,016x, avec x la masse de phosphate en µg

x= ((ABS + 0,001)/0,1311)*1/M

• 50µL de fraction dans le milieu de réaction (MR)

0,5mL de surnageant 🡪 (0,078+0,001)/0,1311 = 0,603 µg/mL

1 mL de surnageant 🡪 (0,136+0,001)/0,1311 = 1,05 µg/mL

• 100µL de fraction dans le MR

0,5mL de surnageant 🡪 (0,086+0,001)/0,1311 = 0,664 µg/mL

1 mL de surnageant 🡪 (0,129+0,0108)/0,1311 = 0,990 µg/mL

Ensuite on fait une moyenne pondérée des 4 essais (on prend la moyenne pour la fraction à 50µL et 100µL).

Moyenne pondérée = ((0,603*4)+(1,05*2)+(0,664*2)+0,990)/4)/10 = 0,171 µg/mL

•  Milieu réactionnel = 0,5 mL du milieu qui a réagi durant 15 min (0,1 mL de Glu-6-P + 0,3 mL de tampon maléate + 0,1 mL de fraction ou + 0,05 mL de fraction avec 0,05 mL de Sacch)

nmilieu réactionnel = V5 x [P] moyenne = 2,5 * 0,171 = 0,428 µg

Activité volumique = Qtité de protéine/Vprise d’essai = 0,428/0,1 = 4,28 µg/mL

Activité enzymatique = Activité volumique/Masse volumique de P = 4,28E-6/ 31 = 0,138 µmol/mL

Calcul de AET

AET = activité enzymatique / t de réaction = 0,138/15 * 2,4

On multiplie par 2,4 pour ramener au volume de la fraction Vf=2,4

AET = 0,138/15 * 2,4 = 9,2e-3 * 2,4 = 0,023 µmol de phosphore libéré min-1.

Calcul de AES

AES = AET / n protéine total = 0,023/15 = 0,00153 = 1,53E-3 µmol de phosphore libéré par min-1

III – Mesure de l’activité cytochrome C oxydase dans la fraction

Courbe en annexe 3 et 4.

Pour 10µL de fraction de microsome pur

• 10µL = ∆A/∆t = 0,921/60 = 0,015 min-1
• 20µL = ∆A/∆t = 0,917/60 = 0,015 min-1

Moyenne pondérée = (2*0,015+0,015)/2 = 0,0225 min-1

On utilise la loi de Beer-Lambert

∆A = ∆C * ε * l

∆C/∆t = ∆A/∆t * 1/( ε * l ) = a / ∆t * ε * l

∆C/∆t = 0,0225/19800 = 1,136e-6 mol/L/min

AET = 0,02272 nmol/min-1

AES = AET/Qprot = 0,02272/15 = 1,51E-3 nmol/min/mg de protéine.

Donc activité totale Cytochrome oxydase = 0,02276 nmol/min.

IV – Dosage des acides nucléiques dans la fraction