Compte Rendu Tp

rate négative.

Quant à la souche 5, nous obtenons des colonies dans les milieux LB et MC mais pas dans le milieu MMC, alors nous émettons l’hypothèse que cette souche est gram négatif et citrate négative.

Pour toutes les 6 souches, nous avons obtenus des colonies dans le milieu LB, alors c’est avec ces colonies que nous continuerons notre étude.

2.Le test de mobilité:

Afin d’étudier la mobilité de la souche 2 , nous procéderons à la technique de Swimming et Swarming.

Les bactéries peuvent être équipées d’un ou plusieurs flagelle(s) leur permettent de se déplacer. La bactérie évoluant dans un milieu se déplace selon des gradient de concentration pour se rapprocher de sa ‘nourriture’.

La solution mère ayant une DO600 =8,18, ce qui correspond à 8,18.109 UFC/ml, pour obtenir dans 10ml de bouillon LB une DO600 ~0,1nous mélangeons dans le LB un volume de 125µl de cette solution mère.

Nous incubons le mélange à 30°C et lorsque celui-ci atteint la phase exponentielle de croissance, nous mesurons la DO600 et obtenons 0,309>0,2.

Ensuite, pour obtenir des suspensions bactériennes à 108 UFC/ml , nous mélangeons 323µl de solution préalablement préparée(DO600=0,309) avec du LB pour un volume total de 1ml. Nous prélevons de cette suspension bactérienne 10µl que nous déposons sur une boite de pétri de LB-agar à 0,3% et 10µl sur une autre à 0,7% .

Nous incubons pendant 24h à 30°C.

Résultat et analyse:

Enfin , nous obtenons une propagation dans le milieu LB-agar 0,3% de 1,1cm et 0,8cm dans celui à 0,7%.

Nous observons au microscope à l’état frais des cellules de la zone Swimming et de celle de Swarming.Suite à ces observations, nous déduisons que la souche 2 est immobile.

3.Les test catalase:

Ce test nous permet d’observer une présence ou non d’une activité catalase chez nos deux cultures bactériennes dans le milieu LB.

Pour chaque souche, nous déposons sur une lame du peroxyde d’hydrogène toxique(H2O2), dans lequel nous rajoutons la culture bactérienne en milieu LB de la veille.

Résultat et analyse:

Nous observons immédiatement pour les deux souche la formations des bulles d’oxygène. Les souches 2 et 5 sont donc catalase positive, ce qui signifie que nous disposons de microorganismes aérobies, des entérobactéries ou des staphylocoques.

4.Relation des bactéries avec l’oxygène:

Pour pouvoir déterminer le type respiratoire de nos deux souches bactériennes dans un milieu, nous étudions la croissance bactérienne dans un milieu dont la pression en oxygène est égale ou inferieure à celle de l’air. Pour cela, nous utilisons le milieu VF(viande-foie) placé dans un tube fin pour chaque souche.

Après avoir mis en ébullition pendant 20min les tubes contenant le milieu VF, nous laissons reposer jusqu’à atteindre une température de 45°C .Nous les vortexons afin d’homogénéiser la solution.

Nous ensemençons ensuite à l’aide d’une pipette Pasteur en remontant en spirale.

Nous étuvons quelques instants plutard les tube VF contenant la souche 2 à 30°C

et celui contenant la 5 à 37°C pendant 24h.

Résultat et Analyse:

Nous examinons les tubes afin de préciser le type respiratoire de la souche.

Pour la souche 2, nous observons un trouble et selon la profondeur nous déduisons que cette souche bactérienne est aérobie stricte contrairement à la souche 5 qui est quant à elle anaérobie stricte.

5.Etude de la sensibilité aux antibiotiques:

Afin de déterminer l’identité bactérienne , il nous faut étudier sa résistance aux antibiotiques. Ce test est traduit grâce à la détermination de la concentration minimale inhibitrice(CMI) et l’antibiogramme en milieu solide.

Pour se faire , nous effectuons une dilution en cascade d’une bactéries E.Coli GY8696(lot B) avec du LB.

Nous préparons 2 tubes contenant chacun 10ml de suspension bactérienne en LB à 106 UFC/ml. Sachant que la DO600 du lot B est de 4,36=4,36.109.

La solution mère d’un volume réactionnel égal à 1ml et d’une concentration de 32mg/L est préparée avec 10µL d’antibiotique .C’est avec cette solution que nous procédons à la dilution en faisant varier la concentration en antibiotique mais en maintenant celle de la bactérie pour avoir une gamme de concentration de 16-8-4-2-1-0,5 et 0 mg/L. Nous effectuons cette dilution avec deux antibiotiques différents(Ampicilline et Chloramphénicol).

Ensuite , les 16tubes(car 2 tubes servent de contrôle pour chaque série ) sont incubés à 37°C pendant 24h.

La CMI étant la plus faible concentration d’antibiotique capable d’inhiber dans un milieu toute culture visible de la souche étudiée , en observant les tubes préalablement incubés la veille, nous déterminons à quelle concentration minimale non détectons une inhibition de la culture visible d’E.Coli.

Résultat et analyse :

Pour l’ampicilline, nous obtenons CMI=?

Pour le chloramphénicol, nous obtenons ,CMI=?

Suite à l’erreur de manipulation, nous n’avons pu obtenir ces résultats.

Une fois avoir déterminer la CMI, nous passons à l’antibiogramme en milieu solide. Celui-ci se fait avec la suspension bactérienne à 106 UFC/ml déjà préparée.

Nous ensemençons par inondation d’un milieu LB-agar avec les 3ml restant de la suspension .Sans oublier d’éliminer l’excès de liquide , nous laissons sécher la boite pendant un quart d’heure à 37°C. Ensuite nous déposons les disques antibiotiques (ampicilline et chloramphénicol) à 2cm du bord séparément à l’aide d’une pince flambée.Nous renversons la boite et laissons pendant une demi-heure puis l’incubons pendant 24h à 37°C

Résultat et analyse:

Nous mesurons les 2 diamètres des cercles obtenus et trouvons pour l’ampicilline 31mm>D=19mm.Cela signifie que E.Coli GY8696 est sensible à l’ampicilline. Et pour le chloramphénicol 34mm>D=23. E.Coli GY8696 est aussi sensible au chloramphénicol.

6.Relation DO600 /UFC:

Pour déterminer la relation de l’absorbance à 600nm avec le nombre d’unités formatrices colonies(UFC), nous procédons à une dilution successive de raison 10 du lot B à 4,36.10^9UFC/ml dans de l’eau physiologique jusqu’à obtenir 10^3UFC/ml. Nous étalons ensuite 100µL de la dilution à 10^3 UFC/ml et celle à 10^4 UFC/ml sur un milieu LB-agar.

Résultat et analyse:

Apres avoir incubé pendant 24h à 37°C, nous trouvons pour la dilution à 103 UFC/ml 86UFC ~100UFC , ce qu’on devrait avoir théoriquement , alors pour cette dernière dilution la relation 1unité DO600 correspond à une densité de 109 UFC/ml est vérifiée.

Quant à la dilution à104 UFC/ml, nous comptons 638 UFC au lieu de 1000UFC, la relation n’est pas vérifiée , ceci s’explique par le fait que cette avant dernière dilution est plus concentrée, ce qui implique que les colonies obtenues sont tellement nombreux qu’au lieu d’en compter deux parfois nous en

comptons une , donc faute de distinction vue le rapprochement.

II. Observations macroscopiques :

Pour les observations macroscopiques , nous observons sous une loupe à l’œil nu les colonies poussées sur nos boites ainsi que celles des autres binômes. Ces observations vont nous permettre d’avancer dans l’identification des bactéries en analysant leurs aspects telles que la morphologie, la taille , les bordures, l’élévation , la coloration , l’opacité , la pigmentation etc.

Ces analyses nous permettront de classer les différentes souches bactériennes selon leurs types théoriques .Pour chaque souche , nous résumons dans le tableau en annexe. Les souches 2 et 5 étant celles que nous avons étudié le long du TP.

III. Observations au microscope optique(grossissement 103):